Summary
우리는 대부분의 빛을 반사 현미경에 맞게 설계된 저가의 극저온 단계의 제조를 보여줍니다. 이 연구소 - 건설 극저온 단계 cryo - 빛과 cryo - 전자 현미경 사이에 효율적이고 신뢰할 수있는 상호 이미지 수 있습니다.
Abstract
cryo - 가벼운 현미경 (cryo - LM)과 cryo - 전자 현미경의 결합 (cryo - EM)은 세포 역학과 ultrastructure을 이해하는 장점 번호를 포즈. 첫째, 전지는 두 기술에 대한 거의 원시 환경에서 몇 군데 있습니다. vitrification 과정으로 인해, 둘째로, 샘플은 빠른 물리적 고정보다는 느린 화학적 고정에 의해 보존되어 있습니다. 셋째, 이미지는 cryo - LM 및 cryo - EM 모두 같은 예제는 하나의 세포가 아닌 "대표 샘플"의 비교에서 데이터의 상관 관계를 제공합니다. 이러한 혜택을 잘 이전 연구에서 알려져 있지만, 상호 cryo - LM 및 cryo - EM 유해 널리 사용은 적합한 극저온 가벼운 현미경 단계를 사거나 건물의 비용과 복잡으로 인해 제한. 여기서 우리는 조립을 설명하고, 지역의 하드웨어와 식료품점에서 발견된 부품 달러 미만 40 어떤 실험실에서 조작된 수있는 저렴한 극저온 단계 중 하나를 사용하십시오. 이 cryo - LM 단계는 긴 작동 거리 공기 목표 장착되어 아르 반사광 현미경과 함께 사용하도록 설계되었습니다. 상호 cryo - LM 및 cryo - EM 연구, 우리는 표본의 지원으로 탄소 코팅 표준 3 - mm cryo - EM의 격자의 사용을 개작. 그리드에 샘플을 adsorbing 후 샘플을 vitrifying 및 전송 / 격자를 처리 이전에 설립된 프로토콜은 다중 기술 이미징을 허용하기 위해 다음 있습니다. 따라서,이 설치 프로그램은 반사광 현미경있는 모든 무기를 냉동 수산화 샘플의 직접적인 상호 이미지에 액세스할 수 있습니다.
Protocol
1. 제작 및 조립
- .. 그림 1C에 표시된 22.96 cm (9 ") 파이 냄비 냄비의 측면에서 약 2cm, 검은색 마커 펜, 알루미늄 방열판에 대한 마크 구멍 참고를 사용하여 내부의 알루미늄 방열판을 장소 : 경우 알루미늄 블록이 (에서 지역 고철 가게 또는 온라인에서 구입 http://www.onlinemetals.com ) 사전 뚫고 구멍이 오지 않습니다, 당신은 구멍이 몰락하고 알루미늄을 확보하기 위해 1 단계로 이전 접시하도록 주선해야합니다 파이 이동 차단. 우리는 질소 가스의 거품이 알루미늄 아래에서 탈출 수 있도록 플랫폼을 4 추가 구멍에 블록을 확보 5 구멍을 사용합니다.
- 알루미늄 방열판의 위치 근처 cryo - 격자 상자를 놓고 노치와 각 측면을 표시합니다.
- 알루미늄 방열판 구멍에 대한 # 17 드릴 비트 및 cryo - 격자 상자 구멍에 # 35 드릴 비트를 사용하여 각 표시된 위치에 대한 파일럿 구멍을 드릴.
- 5를 사용하고 알루미늄 방열판을 마운트 - # 10, 1.9 cm (3 / 4 ") 민머리 홈 붙이 볼트와 해당 너트뿐만 아니라 15 - # 10 와셔 두 개 알루미늄 블록 아래 세탁기와 뒷면에 세 번째. . 각 구멍 참고를위한 파이 팬 :보기 영역 근처의 알루미늄 블록의 보안되지 overhangs는 무대의 이미징 기능을 제한 진동이 발생할 수있는 모든 마운팅 볼트가 확고하게 강화되어 있는지 확인합니다..
- 삽입 3 - # 4 0.95 cm (3 / 8 ") cryo - 격자 상자 마운트 역할을 파이 팬 뒷면의 홈 붙이 볼트와 너트를 해당 라운드.
- 또 꼭대기에 한 젓가락과 쌍 4 젓가락 함께 테이프. 스페이서 역할을하는 케이크 냄비의 맞은편 가장자리에 테이프 각 쌍을.
- 케이크와 파이의 젖은 위쪽과 아래쪽 표면 ddH 2 O.로 각각 냄비
- 스프레이 거품 절연 두 레이어 케이크 팬을 채우십시오. 다음 단계로 진행하기 전에 각각의 레이어를 젖음.
- 거품에 파이 팬을 누르십시오.
- 거꾸로 팬 플립과 스페이서가 파이 팬에 문의 때까지 케이크 팬에을 누르십시오. 케이크 팬 위에 어떤 가중치 물체를 놓고 치료 밤새 앉아 보자.
- 톱니 모양의 나이프로, 초과는 냄비의 가장자리에서 스프레이 거품 절연 건조 버려야하고 젓가락을 제거합니다.
- 파이 팬의 케이크 팬을 제거합니다. 알루미늄 방열판과 파이 팬은 현재 단열재이며, "극저온 무대"(그림 1A)이라고합니다.
- 극저온 무대의 맨 위에 투명한 플라스틱 클립 보드 (모든 색상과 두께 이상 3mm) 장소. 검은 표지 약 1.5 배 하나의 둥근 cryo - 격자 상자의 직경 동그라미를 그림으로써 cryo - 격자 상자 마운트의 위치를 표시합니다. 1.9 cm (3 / 4 ")로 구멍을 잘라 구멍을 보았다.이 클립 보드에이라고도한다"로딩 화면 "(그림의 1B).
- 극저온 무대와 직접 목적 렌즈 아래에있는 방열판과 함께 현미경에 장소 위에 새로운 투명한 클립 보드에 넣고. 그들은 회전으로 검은색 마커와 목표의 경로를 표시합니다.
- 클립 보드의 가장자리에서 반 동그라미를 제거 표시된 선을 따라 잘라. 이것은 퍼즐이나 동영상과 같이 구멍을 여러 번 보았다 7.62 cm (3 ")를 이용하여 수행할 수 있습니다.
- 마지막으로 접시의 영역 내에서 하프 서클에서하지만, 여전히 1.9 cm (3 / 4 ") 구멍을 뚫고.이 포트 될 수준 드롭하는 경우 이미징.이 클립 보드에이 언급되지만 액체 질소 (lN 2) 충진을위한 "보는 화면"(그림 1C)로.
2. 샘플 준비
- 1x10 6 셀 / 물에 ML의 적절한 농도로 합성 전체 (SC) 미디어 재배 로그 위상 효모 세포를 희석.
- 희석 효모 2 ML은 R2 / 1 400 메쉬 홀리 탄소 코팅 구리 cryo - EM 그리드 (SPI 용품, 웨스트 체스터, PA)에 pipetted 15 초 동안 adsorb 수 있습니다.
- 2 초 부드러운 셀룰로오스 조직의 찢어진 조각 (Kimwipe)에 그리드의 뒷면을 만져 격자 표면 가까이 초과 액체를 얼룩.
- 필요한 경우, 격자 3 μL의 물을 방울 (1-3 회)하고, 악한 거리에 3 단계에서와 같이 뒤쪽에서 모래 바닥에서 함께 세탁하실 수 있습니다.
- 최종 세척하기 전에 샘플 공압 플런지 냉동고에로드되고 매달려 그리드는 2.4 단계로 세탁합니다. 표면에서 물의 대부분을 제거하는 찢어진 티슈 (Kimwipe)로 격자를 모래 바닥 후, 격자는 액체 에탄을 냉각 lN이 속으로 뛰어들하고 저장 1 참고를위한 cryo - 격자 상자로 전송 :. 그것은 중요합니다 샘플 수산화 유지하기 위해 표면에 가능한 얇은 같은 액체의 레이어를 두십시오. 부적 절한 모래 바닥도 샘플을 건조 또는 전자빔을 불투명 얼음을 떠날 것입니다.
3. Cryo - 라이트 현미경
- 극저온 무대로 채워lN 2는 빠르게 로딩 화면 (싱글 1.9 cm (3 / 4 ") 구멍이있는 플라스틱 클립 보드)를 커버.
- 일단 금속 부분 A5에서 설명하는 3 개의 나사에 의해 만들어진 마운트 1.9 cm (3 / 4 ") 로딩 화면의 구멍을 통하여 전송에 cryo - 격자 상자를 전송, lN이 온도에 도달합니다. 돌려서 cryo - 격자 상자 의 홀더에서합니다. 향상 액세스를위한 홀더를 제거 단계를 3.10까지 별도의 듀어에 lN이 아래 cryo - 격자 상자 홀더 보관하십시오. cryo - 격자 상자도 샘플 그리드 온난 화를 방지하기 위해 lN 2 조에 보관해야합니다.
- . 단 알루미늄 방열판의 상단에 아래의 극저온 단계에 리필 lN 2 주 : lN이 수준을 정기적으로 체크하고 lN 2 방열판과 접촉 지속되도록 이미징 과정 리필해야합니다. 일반적으로 충진이 보는 화면에서 입력 포트를 통해 10 분마다 발생합니다.
- lN 2 미리 시원한 트위터 팁 다음 1.9 cm (3 / 4 ") 로딩 화면의 구멍을 사용하여 핀셋으로 알루미늄 방열판의 평면 볼 표면에 귀하의 격자 (들)을 전송합니다.
- 조심스럽게 반사 조명 현미경의 목표 apertures 아래에 cryo 단계로 이동합니다.
- 로딩 화면 위에 투명한보기 화면을 놓습니다. . 그런 다음 천천히 보는 화면 참고 아래를 슬라이딩하여 로딩 화면을 제거합니다이 시점에서, 샘플은 가장 취약합니다. 현미경 주위에 모든 공기 흐름이 포함 최소화한다 : 가까운 문이 열린 사람들은 과거의 산책, 호흡 등 우리는 안면을 입고하거나 예방책으로 현미경 eyepieces 아래 투명한 얼굴 방패를 달아 좋습니다.
- cryo 단계 및 평면 방열판보기 영역에있는 샘플에 대한 검사의 차가운 질소 가스 환경에 목적 렌즈를 회전합니다. 센터를 찾아 개요 이미지을 위해 낮은 배율 목적으로 그리드에 대한 표준 명시야 조명 현미경 기술의 초점을 사용합니다. 본 실험에 사용된 조명 현미경 렌즈에 관한 스펙은 실험 자료 섹션에 나열되어 있습니다 참고 :. lN 2 목적 렌즈와 접촉하지 않고 우리는 냉각의 영향에서 이미지 또는 렌즈 손상의 저하를 볼 아직 .
- 관심 지역에 높은 배율에서 초점 명시야, 암시야, 편광 또는 형광 이미징 데이터를 취득. 미래의 상관 관계에 대한 낮은 배율 명시야 이미지에 관심 영역의 위치를 기록해야합니다. lN 2 충진을 위해 위에 나열된 모든 예방 조치가 뒤에있다면 증발 질소의 긍정적인 압력이 영상의 기간 동안 무료로 환경을 오염 (객실 습도 독립) 유지하기 위해 충분합니다.
- 끝나면보기 화면 상단을 통해 그것을 슬라이딩하여 로딩 화면을 바꿉니다. 로딩 화면 아래를 슬라이딩 둔화하여보기 화면을 제거합니다.
- 현미경에서 cryo 단계를 제거하고 미리 냉각 핀셋으로 cryo - 격자 상자에 다시 격자를 전송합니다. 환경에 대한 봉인 및 스토리지와 미래의 이미지에 대한 lN2 듀어에 홀더를 전송하는 cryo - 그리드 상자에 cryo - 격자 상자 홀더 나사.
4. Cryo - 전자 현미경
- 항상 액체 질소 온도에서 표본을 유지하면서 표준 및 구축 기법에 따라, cryo - EM 전송 홀더에 샘플 격자를로드합니다.
- 전송 전자 현미경에 샘플 격자와 cryo - 홀더를 삽입합니다.
- 적합한 낮은 배율보기 (50 - 500x 공칭 배율)에서 샘플 격자의 중심을 찾으십시오.
- 그리드의 중앙 구리 탭의 상대적 방향을 (그림 2에서 설명) 확인하고 상관 관계에 대한 관심의 정확한 지역을 식별하는 단계 3.7에서 이전에 수집된 낮은 배율 cryo - LM 데이터를 사용합니다.
- 현미경 정렬, 낮은 복용량 cryo - EM 영상과 데이터 수집을 진행.
5. 대표 결과
극저온 단계 (그림 1A)는 cryo - 형광 현미경과 상호 cryo-LM/cryo-EM 분석을 위해 cryo - LM 데이터를 수집하는 효과적인 방법입니다. 그림 2는 낮은 높은 배율 cryo - LM 이미지의 조합이 당신이 cryo - EM의 특정 영역에 대한 직접 참조지도를 만들 수 있도록하는 방법을 보여줍니다. 결과 cryo - LM 참조지도 (그림 2B)는 그림 3에 표시된 정확한 지역을 찾을 수 cryo - EM 데이터 수집 동안 이용되었다.
그림 1. 극저온 무대.) 극저온 단계의 레이아웃은 마운트가 w를 표명 cryo - 격자 상자를 전송로 구성되어 있습니다ith 흰색 화살표와 알루미늄 방열판. 격자는 cryo - 격자 상자에서 lN 2 조에 전송과 검정색 화살표로 방열판의보기 영역에 직접 배치. B) 이미지 화면 로딩과 함께 극저온 단계를 묘사하고 있습니다. 포트 샘플을 전송하고 핀셋으로 방열판에 샘플보기 영역에 cryo - 격자 상자에서 샘플을 이동하십시오. C) 극저온에로 로딩 화면에 구멍이 cryo - 격자 상자를 탑재하고 행동을 통해 직접 배치됩니다 장소에 보는 화면과 목적에 따라 렌즈 위치에 무대. 보기 화면에서 특별 컷아웃은 객관적 렌즈가 쉽게 극저온 무대를 이동하지 않고 위치로 스윙 할 수 있습니다. 멀리 샘플 영역에서 보는 화면의 구멍이 필요한 경우 lN이 수준을 보충하기 위해 포트를 채울 lN이 역할을합니다.
그림 2. 상호 연구 cryo - LM의 탐색은. 효모 세포의) 낮은 배율 cryo - LM보기 샘플 모눈을 준수. B)에 동일한 이미지가 (A) 관심 지역의 높은 배율 형광 이미지를 중첩 그리고 채워진 다각형 오렌지와 샘플 격자의 중심을 표시. 센터는 별도의 금속 탭을 앞으로 오픈하는 데 사 사각형, 세 그룹으로 구성되어 있습니다. 추가 금속 탭을와 세번에 대한 두 쌍은 비대칭 중심을 형성 장기 및 단기 축에 대한 탭을 공유할 수 있습니다. 이 비대칭 센터는 왼쪽 상단에서 볼 수 있으며, cryo - LM 및 cryo - EM 사이의 격자의 회전 각도와 handedness를 표시하는 데 사용되었다. 관심 중 하나가 낮은 배율 이미지 여러 지역에서 표시 할 수 있습니다 cryo - EM에서 동일한 영역을 찾을 참조지도로 사용. (B)에 대한 관심의 영역 C) 확대 형광 cryo - LM 이미지. HTA1 - CFP, C - 터미널 CFP 히스톤 마커가, 핵의 위치를 라벨 녹색 작은 반점이있는 구조로 볼 수 있습니다.에서는 해당 지역의 D) cryo - EM 이미지 (C). 스케일 바가 50 미크론을 나타냅니다.
그림 3. cryo - LM 및 cryo - EM의 상관 관계. 동일한 효모 세포를 묘사 볼 두 가지 분야가 (C, F cryo - 명시야 (A, D), cryo - 형광 (B, E), 그리고 cryo - EM과 상관 ). 스케일 바는 5 미크론을 나타냅니다.
Discussion
Disclosures
저자는 경쟁 금융 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 본 연구에서 사용되는 효모 변형에 대한 액세스를 제공하는 브랜든 J. Zipp와 켄 B. 카플란 감사하고 싶습니다. 저자는 또한 찍고와 지원을 훌리오 레닌 도밍게즈 - 라미레즈 감사합니다. 말씀 그랜트 번호 5RC1GM91755에서 NIH 자금 지원을 인정한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 – 22.86 cm (9") pie pan with sloped edge | Good Cook | Local grocery store | |
| 1 – 22.86 cm (9") cake pan | Good Cook | Local grocery store | |
| 4 pairs of chopsticks | Local grocery store | ||
| 1 - Great Stuff spray foam | Great Stuff | Local hardware store | |
| 1 - 4cm x8cm x1cm block of aluminum | Local hardware store or metal scrap yard | ||
| 5 - #10 1.91 cm (3/4") flat head slotted bolts w/ nuts | Local hardware store | ||
| 3 - #4 0.95 cm (3/8") round slotted bolts w/ nuts | Local hardware store | ||
| 15 - #10 washers | Local hardware store | ||
| 2 - transparent plastic clipboards | Local office store | ||
| 1 - Cryo-EM grid box holder | Ted Pella | 160-41 | |
| 1 - Cryo-EM grid box handling rod | Ted Pella | 160-46 | |
| 1 - R2/1 holey carbon film, 400-mesh copper cryo-EM support grid | SPI Supplies | 4340C-XA | |
Experimental materials |
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References
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