De stijfheid van de extracellulaire matrix van grote invloed op meerdere gedragingen van hechtende cellen. Matrix stijfheid varieert ruimtelijk overal een weefsel, en ondergaat wijzigingen in de verschillende aandoeningen. Hier hebben we methoden ontwikkelen om de ruimtelijke variatie in stijfheid in normale en fibrotische muis longweefsel met behulp van atomic force microscopie microindentation karakteriseren.
Matrix stijfheid van grote invloed op de groei, differentiatie en functie van hechtende cellen 1-3. Op de macroschaal de stijfheid van weefsels en organen in het menselijk lichaam over meerdere orden van grootte 4. Is veel minder bekend over de manier waarop stijfheid varieert ruimtelijk in de weefsels, en wat de omvang en de ruimtelijke schaal van stijfheid veranderingen bij de ziekte van processen die resulteren in remodellering van het weefsel. Om beter te begrijpen hoe veranderingen in de matrix stijfheid om cellulaire fysiologie bij te dragen in gezondheid en ziekte, zijn de metingen van weefsel stijfheid verkregen op een ruimtelijke schaal die relevant zijn voor inwoner cellen die nodig zijn. Dit geldt met name voor de longen, een uiterst meegaand en elastisch weefsel waarin matrix remodeling is een prominente functie in ziekten zoals astma, emfyseem, hypertensie en fibrose. Te bepalen wat de lokale mechanische omgeving van longparenchym op een ruimtelijke schaal die relevant zijn voor inwoner cellen, hebben wij methoden ontwikkeld om rechtstreeks de lokale elastische eigenschappen van verse muizen longweefsel met behulp van atomic force microscopie (AFM) microindentation. Met de juiste keuze van de AFM indringlichaam, cantilever, en inspringing diepte, deze methoden is het mogelijk metingen van de lokale weefsel afschuifmodulus in parallel met fase contrast en fluorescentie beeldvorming van de regio van belang. Een systematische bemonstering van weefsel strips biedt kaarten van weefsel mechanische eigenschappen die lokale ruimtelijke variaties in afschuifmodulus onthullen. Correlaties tussen de mechanische eigenschappen en de onderliggende anatomische en pathologische kenmerken illustreren hoe stijfheid varieert met matrix depositie in fibrose. Deze methodes kunnen worden uitgebreid tot andere zachte weefsels en de ziekte-processen te onthullen hoe de lokale weefsel mechanische eigenschappen variëren door de ruimte en de progressie van de ziekte.
Mechanische karakterisatie van longweefsel met AFM microindentation biedt ongekende ruimtelijke resolutie (afb. 4), biedt een uniek perspectief op microschaal variaties in weefsel stijfheid. Als voorbeeld van het nut ervan, vorige macro-schaal metingen in normale en fibrotische longweefsel strips aangegeven een ongeveer 2-3-voudige toename in elastance met fibrose 11,12. In tegenstelling, AFM microindentation blijkt dat weefsel verstijving is zeer plaatselijk, met een aantal regio's vertonen tot ~ 30-voudige toename van de shear modulus boven de mediaan bij normale, longweefsel 10. Als matrix stijfheid is nu bekend om kritisch te beïnvloeden celfunctie, deze lokale metingen geven van onschatbare waarde parameters om de biofidelity van celkweek onderzoek van longcellen te verbeteren.
Een aantal praktische problemen ontstaan bij het gebruik van dunne stroken van longweefsel. De oppervlakken van de strips zijn niet volledig vlak, zoals het weefsel profiel volgt de architectuur van de onderliggende longblaasjes. De AFM-systeem past zich automatisch tip positie in de Z-richting tijdens inspringen wanneer het monster oppervlak hoogte van variatie is kleiner dan 15 micrometer, om te helpen deze uitdaging te overwinnen. Metingen zijn verricht bij kamertemperatuur, niet 37 ° C, zodat afwijkingen in de mechanische eigenschappen als gevolg van deze variatie in temperatuur kan niet worden geëvalueerd, hoewel ze zouden naar verwachting gering zijn. De invloed van de onderliggende alveolaire wand architectuur op waargenomen mechanische eigenschappen is moeilijk vast te stellen met de huidige lichtmicroscopie setup. Zo zou het wenselijk zijn om te bepalen of alveolaire wanden vertonen anisotropie en de verschillende mechanische eigenschappen als ingesprongen in richtingen uitgelijnd met of dwars op het vlak van de muur. Echter, de huidige exemplaren zijn dik en het imaging systeem geen 3D-mogelijkheden, dus is het niet mogelijk om de lokale alveolaire wand oriëntatie te bepalen op elk punt van contact. Ten slotte is de invloed van de cellulaire bestanddelen op de gemeten mechanische eigenschappen nog volledig opgehelderd worden. In de methodes hier worden beschreven, worden er geen inspanningen geleverd om specifiek te verwijderen cellulaire bestanddelen van het weefsel. Echter, de cellen die aanwezig zijn op het oppervlak beschikbaar is voor inspringen waarschijnlijk niet levensvatbaar te zijn gezien de tijd die is verstreken sinds weefsel oogst en de noodzaak van het snijden van het weefsel om de toegang tot de longblaasjes te krijgen. Specifieke experimenten om cellen te verwijderen, of herbevolken matrices met levensvatbare cellen, en evalueren van de daaruit voortvloeiende veranderingen in het weefsel stijfheid lijkt gerechtvaardigd.
Omdat de verse losgemaakte weefsel is nodig voor deze metingen, moet de tijd die verstreken is van weefsel oogst de meting worden geminimaliseerd en de monsters moeten worden bewaard bij 4 ° C op veranderingen in de mechanische eigenschappen te voorkomen. Bijzondere aandacht moet worden besteed wanneer weefsel strips worden overgedragen tussen de containers tijdens het wassen of vlekken, zodat minimale vervorming of beschadiging wordt gegenereerd. Voor de AFM toepassing in vloeistof, een cruciale stap is om het weefsel zo plat mogelijk knippen en het monster immobiliseren op de ondersteunende dekglaasje aan. Indien beschikbaar, kan een geautomatiseerd snijden machine, zoals een vibratome of weefsel snijmachine worden gebruikt voor het plakken van zeer uniforme dikte te snijden. Het is belangrijk om onmiddellijk bevestigen weefsel strips voor AFM-metingen en de verstreken tijd voor het AFM-metingen als het monster uiteindelijk los van de dekglaasjes te minimaliseren. Een nuttige observatie is dat grotere strips lijken te hechten meer stabiel te laten enten te dekken en op zijn plaats te blijven voor een langere looptijd in PBS dan kleinere strips.
AFM microindentation kunnen karakteriseren monsters verspreid over een breed scala van 100 Pa tot 50 kPa (shear modulus) bij gebruik van een standaard 0,06 N / m cantilever met een diameter van 5 micrometer bolvormig tip. Dit bereik kan worden uitgebreid met behulp van sondes met verschillende veerconstanten; AFM probes met sferische glazen tips van 0,6 tot 12 micrometer in diameter en de lente constanten, variërend 0,01 tot 0,58 N / m zijn commercieel verkrijgbaar (bijv. Novascan) en veelgebruikte 3. Met een 5 micrometer bolvormig tip, de theoretische contactoppervlak tussen de tip en weefsel is ongeveer 5-9 um 2 voor 400-700 nm inspringen (Fig. 1A). Kleinere of grotere tips kunnen worden gebruikt om kleinere of grotere schaal van de ruimtelijke resolutie te bieden. Piramidale tips zijn ook gebruikt bij AFM microindentation 13-16, het verstrekken van kleinere contact gebieden en waardoor ruimtelijke resolutie in kaart te brengen, hoewel data fitting is ingewikkelder voor deze tip geometrie.
Een aantal beperkingen van deze methode dient te worden opgemerkt. De long is van oudsher mechanisch niet-invasieve manier gekarakteriseerd, bijvoorbeeld met behulp van druk-volume-analyse 17 of punch-inspringing van de hele longen 19,20. Invasieve methoden, zoals hier beschreven veranderen de longen architectuur in belangrijke manieren door het verlies van de lucht-vloeistof interface die normaal bestaat in de met lucht gevulde longen en het verlies van pre-stress die long gedeeltelijke inflatie houdt op ontspanning van de ademhalingsspieren. Deze beperkingen gelden voor alle metingen die in het longweefsel strips 18. Opvallend is echter de mediaan stijfheid gemeten in de parenchym van normaal longweefsel (afschuifmodulus ~ 0.5kPa) niet wezenlijk verschilt van de schattingen op basis van punch-inspringing van intacte longen bij rust volumes 19,20. Terwijl longweefsel is bekend dat niet-lineaire verstijving vertonen bij toenemende vervorming, is het niet mogelijk om te testen in een rigoureuze wijze de vraag of deze eigenschap naar beneden blijft tot de micro-schaal met de methoden hier werkzaam. De Hertz model gaat uit van homogeniteit van het monster. Echter, de meeste biologische materialen, waaronder longparenchym, worden in toenemende mate heterogeen op het verminderen van ruimtelijke schaal. Heterogeniteit van het monster kan leiden tot artefacten, zoals variatie van de Young's modulus afhankelijk van de diepte inspringen, dat wil zeggen, afhankelijk van de laag of onderdeel dat is vervorming. De heterogeniteit in het xy-vlak kan worden beperkt door het zorgvuldig kiezen van de juiste sferische tip grootte, afhankelijk van de microstructuur van het biomateriaal zoals voorgesteld door Dimitriadis EK et al.. 8 Het is veel moeilijker te voorspellen of te corrigeren van de Hertz model fout te wijten aan materiaal heterogeniteit in de z-richting. Azeloglu et al.. heeft onlangs voorgesteld een hybride computationeel model om de elastische eigenschappen van heterogene ondergrond te karakteriseren met discrete embedded insluitsels 21. Hun nieuwe techniek biedt een potentieel middel om te berekenen opnemen eigenschappen van heterogene materialen het overwinnen van de beperkingen van de Hertz-analyse.
De Hertz model gaat ook absoluut elastisch gedrag, terwijl de biologische materialen meestal weer tijd-afhankelijke visco-elastische gedrag. Een volledige karakterisering van de visco-elastische weefsel kan worden verkregen door het variëren van de gebruikte inspringen snelheden. Belangrijk is dat de vorige macro-schaal mechanische testen van een normale en fibrotische longweefsel toont zwakke frequentie afhankelijkheid van longweefsel mechanische eigenschappen, en het behoud van de verschillen tussen normale en fibrotische weefsel mechanische eigenschappen in alle frequenties testen 11. Deze bevindingen suggereren sterk dat het meten van de mechanische eigenschappen met een enkele inkeping snelheid met AFM een essentieel aspect van de veranderingen in weefsel mechanische eigenschappen die fibrose begeleiden vastlegt.
De Poisson-ratio van 0,4 voor het longweefsel wordt gebruikt in dit werk is van een macroscopische meting 9. Helaas, de Poisson-ratio op micro-schaal en eventuele wijzigingen onder ziektebeeld zijn niet beschikbaar in de literatuur. Als alternatief voor E, E / (1-υ 2) of (1-υ 2) / πE (aangegeven met de elastische constante k) 22 kan worden berekend op basis van AFM microindentation en gerapporteerd wanneer de Poisson-ratio is niet bekend. Voor de meeste biomaterialen Poisson-ratio is in het bereik van 0,4 tot 0,5 vanwege hun hoge gehalte aan water. Binnen het bereik 0,3-0,5, de factor 1 / (1-υ 2) varieert slechts 1.10 tot 1,33, zodanig dat een redelijke variaties in de verhouding van de Poisson oefenen slechts een bescheiden effect op de gerapporteerde modulus. De toename van de shear modulus dat we verslag van fibrotisch weefsel ten opzichte van normaal weefsel is verscheidene malen in grootte, wat inhoudt dat er fouten in verband met variaties in de verhouding Poisson's zijn beperkt ten opzichte van de veranderingen in mechanische eigenschappen waargenomen.
De werkelijke algoritme en de code die kan worden gebruikt voor de analyse van kracht-verplaatsing van gegevens is onderworpen aan de specifieke toepassing conditie en de daarop volgende kenmerken van de verschillende populaties van kracht-verplaatsing curves. Als er meer verfijnde analyse is van belang, kan een raadplegen van het werk van Lin et al.. 23. De auteurs stelde een aantal synergetische strategieën in een algoritme dat veel van de complicaties die eerder hebben verhinderd inspanningen om de montage van Hertz modellen van inspringing gegevens te automatiseren overwint.
Verscheidene andere gebieden zijn beschikbaar voor de verdere ontwikkeling en exploitatie van deze methode. In de gevallen waarin men geïnteresseerd in het visualiseren van de alveolaire wanden, zonder antilichaam labeling, kan zowel elastine en collageen worden gevisualiseerd uit hun autofluorescente signaal in het groene spectrum. Aan de andere kant, beter kunnen imaging, met behulp van dunnere weefselcoupes, 3D-imaging technieken, of beide, verbeteren van de mogelijkheid om weefsel architectuur correleren met de onderliggende mechanische eigenschappen. Terwijl de huidige methoden is het mogelijk kleuring en visualisatie van extracellulaire matrix componenten, zoals collageen en laminine, kunnen extra inspanningen worden gericht op vlekken celoppervlaktemerkers om specifieke celpopulaties te identificeren en om de mechanische micromilieus karakteriseren in de nabijheid van dergelijke populaties. Alternatively, kan weefsel worden verzameld van muizen die fluorescent-gelabelde lijn markers of cel-specifieke eiwitten aan hetzelfde doel na te streven. Ten slotte is de methode gedetailleerde hier lijkt goed geschikt voor het karakteriseren van andere anatomische kenmerken in de longen, zoals schepen die verbouwen bij hypertensie, en luchtwegen die verbouwen bij astma. Op basis van de huidige stand van de ontwikkeling en het potentieel voor verdere verbetering, AFM microindentation lijkt klaar om waardevolle inzichten opleveren in de veranderingen in het weefsel stijfheid die progressie van de ziekte in de longen te begeleiden, en zullen niet van waarde zijn twijfel in het karakteriseren van ruimtelijke en temporele veranderingen in de stijfheid van een verscheidenheid van andere zachte weefsels.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken A. en B. Tager Shea voor hun lopende samenwerking en het verstrekken van het longweefsel wordt gebruikt voor demonstratiedoeleinden hier. Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health subsidie HL-092961. Dit werk werd uitgevoerd in een deel bij het Centrum voor Nanoscale Systems (CNS), een lid van het National Nanotechnology Infrastructure Network, die door de National Science Foundation ondersteund onder NSF award ECS-0335765. CNS is een onderdeel van de Faculteit der Kunsten en Wetenschappen aan de Harvard University.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
AFM tip | Novascan | PT.GS | 5 micron Borosilicate bead, 0.06 N/m |
Poly-L-Lysine coverslips | VWR | 354085 | BD BioCoat 12 mm round No.1 glass |
Agarose, Low Gelling Temperature | Sigma | A0701 | |
Rabbit anti-Collagen I (Rb pAb) antibody | Abcam | ab34710-100 | |
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A11010 | |
Rabbit anti-Laminin | Sigma | L9393 |