जीभ के भीतर लेबल की कोशिकाओं के बहु photon माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मौखिक कैंसर और ट्यूमर आक्रमण की मात्रात्मक निगरानी की एक माउस मॉडल पैदा करने में शामिल तकनीकों का एक व्यापक सिंहावलोकन प्रस्तुत किया है. इस प्रणाली के आणविक और आक्रामक विरोधी यौगिकों की दवा प्रभावकारिता मूल्यांकन के लिए एक उपयोगी मंच के रूप में सेवा कर सकते हैं.
सिर और गर्दन के कैंसर के आक्रमण लोको क्षेत्रीय metastatic जोखिम से जुड़ा हुआ है और डिजाइन और रोगी प्रबंधन रणनीतियों को लागू करने में एक कठिन चुनौती प्रस्तुत है. मौखिक कैंसर के Orthotopic माउस मॉडल कारक है कि अध्ययन की सुविधा के लिए विकसित किया गया है प्रभाव आक्रमण और विरोधी ट्यूमर चिकित्सा विज्ञान के मूल्यांकन के लिए मॉडल प्रणाली के रूप में सेवा. इन पद्धतियों में, मौखिक गुहा के ऊतकों के भीतर फैलाया ट्यूमर कोशिकाओं के दृश्य आम तौर पर या तो पारंपरिक ऊतक विज्ञान के द्वारा या के साथ vivo bioluminescent तरीकों में आयोजित किया गया है. इन तकनीकों का एक प्राथमिक दोष करने के लिए सही कल्पना और जल्दी ट्यूमर कोशिका तीन आयामों में प्राथमिक साइट से उत्पन्न होने वाले आक्रमण यों निहित असमर्थता है. यहाँ हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन है कि दो photon इमेजिंग के साथ एक जीभ के स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (स्काटलैंड का निवासी) के लिए स्थापित मॉडल बहु vectorial बहुभाषी ट्यूमर के प्रसार के दृश्य की अनुमति को जोड़ती है. OSC 19 सिर और गर्दन ट्यूमर कोशिका लाइन stably एफ actin बाध्यकारी पेप्टाइड mCherry फ्लोरोसेंट प्रोटीन (LifeAct mCherry) से जुड़े हुए LifeAct व्यक्त करने के लिए इंजीनियर था. Fox1 / परमाणु परमाणु इन कोशिकाओं के साथ चूहों अंतःक्षिप्त मज़बूती से ट्यूमर है कि जीभ पूर्व vivo दो photon माइक्रोस्कोपी के आवेदन के द्वारा visualized किया जा की अनुमति के रूप में. इस तकनीक ट्यूमर जन के orthotopic दृश्य के लिए और स्थानीय स्तर पर excised जीभ में क्षेत्रीय ट्यूमर microenvironment के विघटन के बिना कोशिकाओं पर हमला करने की अनुमति देता है. इसके अलावा, इस प्रणाली दूरी है कि प्राथमिक ट्यूमर साइट से कोशिकाओं को बढ़ने पर आक्रमण की गणना के द्वारा ट्यूमर सेल आक्रमण की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है. कुल मिलाकर इस प्रक्रिया कारक है कि स्काटलैंड का निवासी आक्रमण और चिकित्सीय उपचार के लिए स्थानीय आक्रमण और दूर metastatic प्रसार को रोकने के अनुरूप करने के लिए योगदान का विश्लेषण करने के लिए एक बढ़ाया मॉडल प्रणाली प्रदान करता है. इस विधि भी अंततः vivo सेटिंग में में अन्य इमेजिंग रूपात्मकता के साथ संयुक्त होने की संभावना है.
Orthotopic माउस मॉडल सिर और गर्दन के कैंसर 1,2 के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए उपयोगी सिद्ध कर दिया है. हम सिर और गर्दन ट्यूमर सेल आक्रमण के प्रारंभिक घटनाओं के अध्ययन के लिए एक प्रणाली के रूप में mCherry लेबल की कोशिकाओं के दो photon माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के साथ एक अच्छी तरह से स्थापित 3 स्काटलैंड का निवासी के orthotopic प्रणाली संयुक्त है. इस प्रक्रिया में, हम उल्लेख किया है कि कोशिकाओं ट्यूमर इंजेक्शन की साइट से छह सप्ताह या छोटी चूहों अपर्याप्त जीभ आकार के कारण में, विशेष रूप से लीक कर सकते हैं. हम बड़े चूहों का उपयोग करने के लिए इस मुद्दे से बचने के. बड़े बड़े चूहों के साथ जीभ आकार भी एक बहुभाषी और जीभ से अत्यधिक ख़ून का बहाव धमनी का टूटना से बचने में एड्स. ट्यूमर ले बहुत बढ़ाया है जब जीभ नाटकीय रूप से प्रारंभिक इंजेक्शन के स्थल पर पहुँच जाती है. इंजेक्शन तरल पदार्थ के रूप में एक – दो घंटे के भीतर यह सूजन उतरे अवशोषित हो जाती है. ट्यूमर के विकास के संकेत इंजेक्शन जीभ की सतह पर एक छोटे सफेद टक्कर के रूप में सेल नंबर के साथ स्पष्ट एक – दो सप्ताह के बाद इंजेक्शन प्रकट होता है. हम यह भी ध्यान रखें कि हमारे यहाँ प्रस्तुत अध्ययन में प्रयोग किया जाता 40x उद्देश्य पर, हम व्यक्तिगत ट्यूमर कोशिकाओं भेद नहीं लेकिन इनवेसिव सेल समूहों कि HNSCC आक्रमण की ठेठ मोड पुनरावृत्ति के रूप में IGS की पहचान कर सकते हैं.
तिथि करने के लिए इस मॉडल बड़े पैमाने पर किया गया है विशेष के अणुओं की भूमिका के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्काटलैंड का निवासी एक आक्रमण विकास पर कई विरोधी ट्यूमर दवाओं गर्भाशय ग्रीवा लिम्फ नोड मेटास्टेसिस निगरानी आईएचसी या bioluminescent 4-7 तरीकों का उपयोग कर से मापा प्रभावकारिता के साथ, परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया. इस प्रणाली जीभ सतह (चित्रा 7) के करीब प्रकट में गठित ट्यूमर, दो photon माइक्रोस्कोपी के आक्रामक बहु सेलुलर समूहों के रूप में स्वस्थानी में छवि पूरे ट्यूमर के लिए आवेदन की अनुमति. प्रक्रिया भी सेलुलर संकल्प के साथ ट्यूमर आक्रमण कल्पना करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. दो photon माइक्रोस्कोपी पहले किया गया है और 8,9 orthotopic और xenograft 8,10 मॉडल में सिर और गर्दन के कैंसर के लिए प्रयोगात्मक उपचार का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया. हालांकि, वहाँ इन रिपोर्टों और हमारे प्रोटोकॉल के बीच दो प्रमुख मतभेद रहे हैं. सबसे पहले, इन अध्ययनों कोशिकी लेबल का उपयोग करने के लिए लक्ष्य / सिर और गर्दन ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान, संभवतः संचलन के लिए पर्याप्त का उपयोग के साथ केवल ट्यूमर कोशिकाओं को पता लगाने के सीमित. दूसरा आक्रमण, ट्यूमर प्राथमिक साइट के लिए करीब कोशिकाओं है कि संभावना recapitulates जल्दी metastatic गतिविधि एक प्रयोगात्मक पैरामीटर के रूप में नहीं मूल्यांकन किया गया था. हमारे प्रोटोकॉल की क्षमता को सीधे किसी भी बिंदु पर माउस जीभ में ट्यूमर प्रगति के दौरान ट्यूमर सेल आक्रमण यों प्रदान करता है. जबकि विधि यहाँ वर्णित प्रक्रिया का वर्णन dissected जीभ का उपयोग करते हुए, हम छवि ट्यूमर आक्रमण bioluminescence के साथ संयोजन में उपयोग के लिए जीवित चूहों में इस विधि के लिए एक साथ जल्दी आक्रमण, स्थानीय लसीका नोड भागीदारी और दूर मेटास्टेसिस की निगरानी के लिए आदत डाल की प्रक्रिया में वर्तमान में हैं वही जानवर. Vivo इमेजिंग में के लिए प्रोटोकॉल के लिए बदलाव स्थिति के लिए एक उपयुक्त मंच के डिजाइन की आवश्यकता होती है और बनाए रखने इमेजिंग के दौरान चूहों, के रूप में एक व्यावहारिक प्रणाली के रूप में अच्छी तरह से ठीक इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान anesthetized चूहों के मौखिक गुहा की सिंचाई. एक बार अनुकूलित किया है, इन रूपांतरों संभावित समर्थक आक्रामक अणुओं और स्थानीय आक्रमण और अधिक दूर बढ़ाया समय अवधि से अधिक पशुओं में metastatic भागीदारी पर परीक्षण आक्रामक विरोधी यौगिकों की भूमिका का अध्ययन करने की क्षमता प्रदान करेगा.
The authors have nothing to disclose.
Supported by a subproject of NIH grant P20 RR16440 and a bridge grant from the West Virginia University Office of Research and Graduate Education to S. Weed. Technical assistance from L. Lopez-Skinner during the early phases of project development is gratefully acknowledged. The authors are also grateful for technical assistance and OSC19 cells from J. Myers and M. Younes (Department of Head and Neck Surgery, M.D. Anderson Cancer Center, Houston, TX); P. Turner and K. Secrest (West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank) for histological processing and procedures, R. Wysolmerski (West Virginia University, Department of Neurobiology and Anatomy) for the LifeAct-mCherry construct and J. Bear (University of North Carolina) for the pLL7.0 lentiviral vector. The use of the West Virginia University Microscopy Imaging Facility (supported by NIH grant P20 RR16440 and the Mary Babb Randolph Cancer Center) and its non-linear optical microscopy laboratory (NLOM; supported by a joint collaboration between the West Virginia University Center for Neuroscience and the West Virginia University Department of Physics/West Virginia Nanoscience Initiative) is also gratefully acknowledged. The NLOM is supported in part by NIH grant P30 RR031155 to the Center for Neuroscience.