에서 곰팡이 Endoglucanase 활동의 높은 처리량 검사 대장균</em
Summary
우리의 곰팡이 endoglucanase 활동을위한 화면으로 저렴한 비용, 높은 처리량 방법을 설명<em> E. 대장균.</em> 방법은, 기판 저하의 단순한 시각적 판독에 의존 효소 정화를 필요로하지 않으며, 확장성이 높은 것입니다. 이것은 효소 변종 대형 도서관의 신속한 심사를 위해 수 있습니다.
Abstract
Cellulase 효소 (endoglucanases, cellobiohydrolases 및 β – glucosidases) 차례로 연료 알콜 1로 변환할 수 있습니다 구성 요소 당분로 hydrolyze의 셀룰로오스. 신재생 에너지를 제공하기 위해 cellulosic 바이오 매스의 효소 가수 분해에 대한 잠재력은 경제적인 연료 생산 2 cellulases을 엔지니어 노력을 강화하고있다. 특히 관심이 이미 식품, 섬유 처리에 대한 산업상 사용되는 곰팡이 cellulases 3-8은 다음과 같습니다.
돌연변이 cellulases의 라이브러리 간의 적극적인 변종을 식별하는 것은 기술 프로세스에 중요합니다, 적극적인 돌연변이가 더욱 향상된 특성 및 / 또는 추가 테스트 돌연변이 유발을 받게 될 수 있습니다. 곰팡이 cellulases의 효율적인 엔지니어링은 기본 생물에 대한 유전자 도구의 부족으로하고 heterologous 호스트에있는 효소를 표현의 어려움에 의해 방해되었다. 최근 모리카와 동료 E.의 표현 방법을 개발 대장균 H. jecorina 3,9, 대량으로 cellulases을 분비하는 능력과 함께 중요한 산업 곰팡이에서 endoglucanases의 촉매 도메인. 기능성 E. 대장균 표현도 Macrophomina phaseolina 10 Phanerochaete chrysosporium 11-12 포함한 다른 곰팡이에서 cellulases에 대한보고되었습니다.
우리는 E.에 곰팡이 endoglucanase 활동의 높은 처리량 검사에 대한 방법을 제시 대장균. (그림 1)이 방법은 고체 매체에 성장 세포에 의해 카르복시 메틸 셀룰로오스 (CMC)의 효소 저하를 시각화하는 일반적인 미생물의 염색 콩고 레드 (CR)를 사용합니다. 활동 분석은 저렴한 시약, 최소한의 조작을 필요로하고, 식민지 사이트에서 열화의 지역 ( "halos")로 모호하지 않은 결과를 제공합니다. 효소 활동의 양적 측정이 방법에 의해 결정되지 않을 수 있지만, 우리는 헤일로 크기가 셀에 총 효소 활동을 상호 것으로 나타났습니다. 개인 긍정적인 클론의 추가 특성은 상대적으로 단백질 적합성을 결정합니다.
전통적인 박테리아 전체 셀 CMC / CR 활동 assays 13 교차 오염, 또는 대규모 실험을 덜받을 수있는 것입니다 CMC 한천 우물에서 잠복기 문화의 적용을받습니다 식민지, 한천에 포함된 CMC를 따르고 포함됩니다. 여기 cellulase 활동 14 기존의 세척 방법을 수정 향상된 프로토콜을보고 : CMC 한천 플레이트에 성장 세포는 이전에 CR의 얼룩을 제거됩니다. 우리 프로토콜은 크게 교차 오염을 줄이고 클론 수천의 급속한 심사를 허용, 확장성이 높은 것입니다. H. 이외에 jecorina 효소, 우리가 표현하고이 프로토콜은 생물의 범위에서 효소에 적용할 수 있다고 제안, Thermoascus aurantiacus 및 Penicillium decumbens (그림 2 참조)에서 endoglucanase 변종을 검사.
Protocol
Discussion
여기에서 설명한 프로토콜은 최소한의 조작으로 활성 효소의 신속하고 높은 처리량 신분증을 수 있습니다. 활동 검출은 매우 민감하고, 질적으로 세포 내에서 활동의 양을 나타냅니다. 사용의 용이성은 E.의 기능적 표현에 의해 제한 효소 라이브러리의 광범위한이 방법은 적합 대장균. 또한 이런 종류의 활동 심사는 곰팡이 cellulases에 국한되지 않고 있지만 endoglucanase의 활동에 적용?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 고든 무어와 베티 재단에 의해 및 UNCF / 머크 과학 이니셔티브에 의해 투자되었다.
Materials
| Reagent | Company | Product number |
|---|---|---|
| IPTG | Sigma | I1284 |
| Congo Red | Sigma | C6277 |
| Carboxymethyl Cellulose | Sigma | 360384 |
| NaCl | Sigma | S1679 |
| Bacto-agar | BD Biosciences | 214030 |
| Bioassay plates | Thermo Scientific | 240845 |
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