신생아 Hypoxia의 생화 학적 측정
Summary
방법은 hypoxia – 국소 빈혈 신생아의 생화 학적 마커를 측정하는 설명되어 있습니다. 접근 방식은 고압 액체 크로마 토그래피 (HPLC)와 가스 크로마 토그래피 질량 분석계 (GC / MS)를 사용합니다.
Abstract
신생아 hypoxia의 국소 빈혈은 조직의 불충 분한 혈액 관류 또는 산소의 체계 부족이 특징입니다. 이 조건은 원인 / 1-3 신경 장해를 포함하여 잘 문서화 신생아 장애를 증명했다 생각합니다. 아데노신 삼인산 감소 생산 산화 인산화 부족으로 인해 발생합니다. 고에너지 인산 채권을 포함하는 에너지 박탈 상태 분자 무마하기 위해 저하 이아르. 이것은 마침내 요산을, hypoxanthine, 크산텐을 이노신하기 위해 이후 타락 아데노신의 증가 수준에 이르게한다. 이 열화 과정의 마지막 두 단계는 크산텐의 산화 환원 효소에 의해 수행됩니다. 이 효소는 normoxic 조건 크산텐 탈수소 효소의 형태로 존재하지만 hypoxia – reperfusion 상황 4, 5 이하 크산텐 산화 효소 (XO)로 변환됩니다. 크산텐 탈수소 효소와는 달리, XO는 purine 저하 4, 6의 부산물로 과산화수소를 생성합니다. hypoxia 동안 생산 다른 반응 산소 종 (ROS)와 함께이 과산화수소가 알란토인을 형성 요산을 산화하고 malondialdehyde (MDA) 7-9을 생성하는 지질 세포막과 반응. 대부분의 포유류는 인간 면제, 어떤 효소 uricase을 가지고 알란토인에 요산을 변환합니다. 인간 그러나, 알란토인은 요산의 ROS – 매개 산화에 의해 형성 수 있습니다. 이 때문에, 알란토인은 uricase을 가진 포유류에없는 인간의 산화 스트레스 마커로 간주하지만,이다.
우리는 신생아 hypoxia의 국소 빈혈의 생화 학적 마커를 측정하는 고압 액체 크로마 토그래피 (HPLC), 가스 크로마 토그래피 질량 분석계 (GCMS)를 고용하는 방법을 설명합니다. 인간의 혈액은 대부분의 테스트에 사용됩니다. uricase 생성 알란토인의 가능성을 인식하면서 동물의 혈액도 사용할 수 있습니다. Purine의 metabolites는 1963 빠르면 hypoxia와 hypoxanthine, 크산텐의 신뢰성에 연결되었고, 신생아 hypoxia의 생화 학적 지표로서 요산이 여러 조사에 의해 10-13 확인되었습니다. purine 화합물의 부량 사용 HPLC 방법은 빠르고 안정적이고 재현할 수 있습니다. 알란토인, 산화 스트레스의 새로운 마커의 부량 사용되는 GC / MS 방법, 지시 사항 외 7 적응했다. 이 방법은 특정 아티팩트를 방지하고 샘플의 낮은 볼륨을 필요로합니다. MMDA의 합성에 사용되는 방법은, 다른 14 15 설명했다. MDA의 GC / MS 기반 부량는 Paroni 외에서 적응했다. 그리고 Cighetti 외. 16, 17. 크산텐 산화 효소 활동이 isoxanthopterin 18 pterin의 전환 quantifying하여 HPLC로 측정되었다. 이러한 접근 방식은 충분히 민감하고 재현할 수이었다.
Protocol
Discussion
방법은 신생아 hypoxia의 국소 빈혈의 평가를 허용 여기에서 설명한. 이 프로토콜도 전반적인 생화 학적 존재의 사진이나 hypoxic 국소 빈혈의 정도를 얻기 위해 에너지 (ATP) 빈곤, 산화 스트레스, 산화 손상, 및 효소 활동의 마커의 측정을 결합한 제품입니다. 이 방법의 유용에도 불구하고, 잠재적인 제한이 있습니다. 첫째, 그것은 assays 모두 실행할 정도로 플라즈마를 수집하는 혈액의 약 1-2 ML 걸립니…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강 R01 NR011209 – 03 국립 연구소에 의해 자금 지원됩니다
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 6ml K3E EDTA K3 tube | Fisher Scientific | 2204061 | |
| 5702R centrifuge | Fisher Scientific | 05413319 | With 13&16MM adaptor |
| 1.5ml microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5599 | |
| 2-Aminopurine | Sigma-Aldrich | A3509 | |
| Varian Cary 100 spectrophotometer | Agilant Technologies | 0010071500 | |
| Savant SpeedVac | Thermo Scientific | SC210A-115 | |
| Micron centrifugal filter device | Fisher Scientific | UFC501596 | |
| Supelcosil LC-18-S Column | Sigma-Aldrich | 58931 | |
| Supelcosil LC-18-S Supelguard cartridge and holder | Sigma-Aldrich | 59629 | |
| HPLC | Waters | ||
| GCMS Vial | Fisher Scientific | 03376607 | |
| DL-Allantoin-5-13C;1-15N | CDN Isotopes | M-2307 | Lot #L340P9 |
| MTBSTFA | Thermo Scientific | 48920 | |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| 5973E GC/MSD | Agilent Technologies | G7021A | Part # for 5975E GC/MS |
| 3-Ethoxymethacrolein | Sigma-Aldrich | 232548 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Benzene | Sigma-Aldrich | 401765 | |
| Diisopropyl ether | Sigma-Aldrich | 38270 | |
| BHT | Sigma-Aldrich | B1378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Phenylhydrazine | Sigma-Aldrich | P26252 |
References
- Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites. J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).
- Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant-current concepts. Early Hum Dev. 80, 125-141 (2004).
- Webster, W. S., Abela, D. The effect of hypoxia in development. Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 215-228 (2007).
- Engerson, T. D., McKelvey, T. G., Rhyne, D. B., Boggio, E. B., Snyder, S. J., Jones, H. P. Conversion of xanthine dehydrogenase to oxidase in ischemic rat tissues. J Clin Invest. 79, 1564-1570 (1987).
- Choi, E. Y., Stockert, A. L., Leimkuhler, S., Hille, R. Studies on the mechanism of action of xanthine oxidase. J Inorg Biochem. 98, 841-848 (2004).
- Godber, B. L., Schwarz, G., Mendel, R. R., Lowe, D. J., Bray, R. C., Eisenthal, R. Molecular characterization of human xanthine oxidoreductase: the enzyme is grossly deficient in molybdenum and substantially deficient in iron-sulphur centres. Biochem J. 388, 501-508 (2005).
- Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations. Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).
- Zitnanova, I., Korytar, P., Aruoma, O. I., Sustrova, M., Garaiova, I., Muchova, J. Uric acid and allantoin levels in Down syndrome: antioxidant and oxidative stress mechanisms?. Clin Chim Acta. 341, 139-146 (2004).
- Siciarz, A., Weinberger, B., Witz, G., Hiatt, M., Hegyi, T. Urinary thiobarbituric acid-reacting substances as potential biomarkers of intrauterine hypoxia. Arch Pediatr Adolesc Med. 155, 718-722 (2001).
- Buonocore, G., Perrone, S., Longini, M., Terzuoli, L., Bracci, R. Total hydroperoxide and advanced oxidation protein products in preterm hypoxic babies. Pediatr Res. 47, 221-224 (2000).
- Berne, R. M. Cardiac nucleotides in hypoxia: possible role in regulation of coronary blood flow. Am J Physiol. 204, 317-322 (1963).
- Harkness, R. A., Lund, R. J. Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine, xanthine, uridine and inosine: high concentrations of the ATP metabolite, hypoxanthine, after hypoxia. J Clin Pathol. 36, 1-8 (1983).
- Plank, M. S., Boskovic, D. S., Sowers, L. C., Angeles, D. M. Biochemical markers of neonatal hypoxia. Pediatric Health. 2, 485-501 (2008).
- Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry. Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).
- Paroni, R., Fermo, I., Cighetti, G. Validation of methyl malondialdehyde as internal standard for malondialdehyde detection by capillary electrophoresis. Anal Biochem. 307, 92-98 (2002).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Ciuffreda, P., Allevi, P. Beta-ethoxyacrolein contamination increases malondialdehyde inhibition of milk xanthine oxidase activity. Free Radic Biol Med. 25, 818-825 (1998).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection. Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).
- Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).
- Fasman, G. . Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. , (1988).
- Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry. J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).
