البيوكيميائية قياس حديثي الولادة نقص الأكسجة
Summary
تم وصف طريقة لقياس علامات الحيوية في الأطفال حديثي الولادة نقص الأكسجين ، نقص التروية. هذا النهج يستخدم ارتفاع ضغط اللوني السائل (HPLC) واللوني للغاز طيف الكتلة (GC / MS).
Abstract
وتتميز الوليدية الإسكيمية نقص الأكسجين التي نضح الدم غير كافية من الأنسجة أو عدم نظامية من الأوكسجين. ويعتقد أن هذا الشرط لسبب / تفاقم الاضطرابات الولدان موثقة جيدا بما في ذلك إعاقة للجهاز العصبي 1-3. انخفض انتاج الأدينوساين ثلاثي يحدث نتيجة لنقص في الفسفرة المؤكسدة. للتعويض عن هذه الجزيئات التي تحتوي على طاقة عالية حرمان الدولة سندات الفوسفات الطاقة هي 2 المتدهورة. هذا يؤدي إلى زيادة مستويات الأدينوساين الذي تدهورت لاحقا إينوزين ، هيبوزانتين ، الزانثين ، وأخيرا إلى حمض اليوريك. يتم تنفيذ المرحلتين الأخيرتين في هذه العملية من قبل تدهور oxidoreductase الزانثين. هذا الانزيم موجود في شكل هيدروجين الزانثين في ظل ظروف normoxic ولكن يتم تحويلها إلى أوكسيديز الزانثين (XO) تحت ظروف نقص الأكسجين ضخه – 4 ، 5. خلافا نازعة الزانثين ، XO يولد بيروكسيد الهيدروجين كمنتج ثانوي للتدهور البيورين 4 ، 6. هذا بيروكسيد الهيدروجين في الجمع مع غيرها من أنواع الاكسجين التفاعلية (ريوس) التي تنتج أثناء نقص الأكسجين ، يتأكسد حمض اليوريك لتشكيل آلانتوين ويتفاعل مع الأغشية الدهنية لتوليد malondialdehyde (MDA) 7-9 ، ومعظم الثدييات ، البشر المعفاة ، تمتلك يوريكاز الانزيم الذي يحول إلى حمض اليوريك آلانتوين. في البشر ، ومع ذلك ، لا يمكن إلا أن يكون شكلتها آلانتوين ريوس بوساطة أكسدة حمض اليوريك. وبسبب هذا ، يعتبر آلانتوين أن يكون علامة من الاكسدة في البشر ، ولكن ليس في الثدييات التي لديها يوريكاز.
نحن تصف أساليب توظيف ارتفاع ضغط اللوني السائل (HPLC) والغاز اللوني الطيف الكتلي (نماذج الدوران) لقياس العلامات الحيوية من نقص التروية نقص الأكسجين الوليدي ، ويستخدم الدم البشرية لمعظم الاختبارات. ويمكن أيضا أن تستخدم دم الحيوان مع الاعتراف احتمال يوريكاز المولدة آلانتوين. وترتبط الأيضات البيورين إلى نقص الأكسجين في وقت مبكر عام 1963 وموثوقية هيبوزانتين ، الزانثين ، وجرى التحقق من حمض اليوريك كمؤشرات البيوكيميائية حديثي الولادة من نقص الأكسجة المحققون عدة 10-13. طريقة HPLC المستخدمة في القياس الكمي للمركبات البيورين سريعة وموثوق بها ، وقابلة للتكرار. تم تعديل طريقة GC / MS المستخدمة في القياس الكمي للآلانتوين ، علامة جديدة نسبيا من الاكسدة ، وآخرون من غروبر 7. هذا الأسلوب يتجنب بعض التحف ويتطلب كميات منخفضة من العينة. ووصف الأساليب المستخدمة لتوليف MMDA في أماكن أخرى 14 و 15. تم تكييفها GC / MS الكمي القائم على نجمة داود الحمراء من Paroni وآخرون. وCighetti آخرون 16 و 17. تم قياس النشاط أوكسيديز الزانثين بواسطة HPLC عن طريق قياس تحويل تيرين isoxanthopterin إلى 18. أثبت هذا النهج لتكون حساسة بما فيه الكفاية وقابلة للتكرار.
Protocol
Discussion
وصفت وسائل تسمح هنا تقييم نقص التروية نقص الأكسجة الولدان. هذا البروتوكول يجمع بين قياسات علامات الحرمان (ATP) والطاقة ، والاكسدة ، والضرر التأكسدي ، ونشاط انزيم للحصول على صورة شاملة للوجود البيوكيميائية أو حتى درجة من نقص تروية ميتة. على الرغم من جدوى هذا الأسلوب ، و?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويتم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة NR011209 R01 – 03
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 6ml K3E EDTA K3 tube | Fisher Scientific | 2204061 | |
| 5702R centrifuge | Fisher Scientific | 05413319 | With 13&16MM adaptor |
| 1.5ml microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5599 | |
| 2-Aminopurine | Sigma-Aldrich | A3509 | |
| Varian Cary 100 spectrophotometer | Agilant Technologies | 0010071500 | |
| Savant SpeedVac | Thermo Scientific | SC210A-115 | |
| Micron centrifugal filter device | Fisher Scientific | UFC501596 | |
| Supelcosil LC-18-S Column | Sigma-Aldrich | 58931 | |
| Supelcosil LC-18-S Supelguard cartridge and holder | Sigma-Aldrich | 59629 | |
| HPLC | Waters | ||
| GCMS Vial | Fisher Scientific | 03376607 | |
| DL-Allantoin-5-13C;1-15N | CDN Isotopes | M-2307 | Lot #L340P9 |
| MTBSTFA | Thermo Scientific | 48920 | |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| 5973E GC/MSD | Agilent Technologies | G7021A | Part # for 5975E GC/MS |
| 3-Ethoxymethacrolein | Sigma-Aldrich | 232548 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Benzene | Sigma-Aldrich | 401765 | |
| Diisopropyl ether | Sigma-Aldrich | 38270 | |
| BHT | Sigma-Aldrich | B1378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Phenylhydrazine | Sigma-Aldrich | P26252 |
References
- Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites. J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).
- Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant-current concepts. Early Hum Dev. 80, 125-141 (2004).
- Webster, W. S., Abela, D. The effect of hypoxia in development. Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 215-228 (2007).
- Engerson, T. D., McKelvey, T. G., Rhyne, D. B., Boggio, E. B., Snyder, S. J., Jones, H. P. Conversion of xanthine dehydrogenase to oxidase in ischemic rat tissues. J Clin Invest. 79, 1564-1570 (1987).
- Choi, E. Y., Stockert, A. L., Leimkuhler, S., Hille, R. Studies on the mechanism of action of xanthine oxidase. J Inorg Biochem. 98, 841-848 (2004).
- Godber, B. L., Schwarz, G., Mendel, R. R., Lowe, D. J., Bray, R. C., Eisenthal, R. Molecular characterization of human xanthine oxidoreductase: the enzyme is grossly deficient in molybdenum and substantially deficient in iron-sulphur centres. Biochem J. 388, 501-508 (2005).
- Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations. Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).
- Zitnanova, I., Korytar, P., Aruoma, O. I., Sustrova, M., Garaiova, I., Muchova, J. Uric acid and allantoin levels in Down syndrome: antioxidant and oxidative stress mechanisms?. Clin Chim Acta. 341, 139-146 (2004).
- Siciarz, A., Weinberger, B., Witz, G., Hiatt, M., Hegyi, T. Urinary thiobarbituric acid-reacting substances as potential biomarkers of intrauterine hypoxia. Arch Pediatr Adolesc Med. 155, 718-722 (2001).
- Buonocore, G., Perrone, S., Longini, M., Terzuoli, L., Bracci, R. Total hydroperoxide and advanced oxidation protein products in preterm hypoxic babies. Pediatr Res. 47, 221-224 (2000).
- Berne, R. M. Cardiac nucleotides in hypoxia: possible role in regulation of coronary blood flow. Am J Physiol. 204, 317-322 (1963).
- Harkness, R. A., Lund, R. J. Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine, xanthine, uridine and inosine: high concentrations of the ATP metabolite, hypoxanthine, after hypoxia. J Clin Pathol. 36, 1-8 (1983).
- Plank, M. S., Boskovic, D. S., Sowers, L. C., Angeles, D. M. Biochemical markers of neonatal hypoxia. Pediatric Health. 2, 485-501 (2008).
- Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry. Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).
- Paroni, R., Fermo, I., Cighetti, G. Validation of methyl malondialdehyde as internal standard for malondialdehyde detection by capillary electrophoresis. Anal Biochem. 307, 92-98 (2002).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Ciuffreda, P., Allevi, P. Beta-ethoxyacrolein contamination increases malondialdehyde inhibition of milk xanthine oxidase activity. Free Radic Biol Med. 25, 818-825 (1998).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection. Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).
- Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).
- Fasman, G. . Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. , (1988).
- Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry. J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).
