Summary
Um método é descrito para medir marcadores bioquímicos de hipóxia-isquemia neonatal. A abordagem utiliza cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e Cromatografia Gasosa Espectrometria de Massa (GC / MS).
Abstract
Isquemia hipóxia neonatal é caracterizada por perfusão sangüínea inadequada de um tecido ou uma falta sistêmica de oxigênio. Esta condição é pensado para causar / agravar bem documentados distúrbios incluindo comprometimento neurológico neonatal 1-3. Trifosfato de adenosina diminuiu a produção ocorre devido à falta de fosforilação oxidativa. Para compensar essa energia moléculas estado privados contendo ligações fosfato de alta energia são duas degradadas. Isso leva a aumento dos níveis de adenosina, que é posteriormente degradado a inosina, hipoxantina, xantina e, finalmente, o ácido úrico. As duas últimas etapas deste processo de degradação são realizadas por xantina oxidoredutase. Esta enzima existe sob a forma de xantina desidrogenase em condições normóxica mas é convertida em xantina oxidase (XO), sob hipóxia-reperfusão circunstâncias 4, 5. Ao contrário de xantina desidrogenase, XO gera peróxido de hidrogênio como um subproduto da degradação da purina 4, 6. Este peróxido de hidrogênio em combinação com outras espécies reativas de oxigênio (ROS) produzidas durante a hipóxia, oxida o ácido úrico a formar alantoína e reage com membranas lipídicas para gerar malondialdeído (MDA) 7-9. A maioria dos mamíferos, os seres humanos isentos, possuem a enzima uricase, que converte ácido úrico em alantoína. Nos seres humanos, no entanto, alantoína só pode ser formado por ROS mediada oxidação do ácido úrico. Devido a isso, alantoína é considerado um marcador de estresse oxidativo em humanos, mas não os mamíferos que têm uricase.
Descrevemos os métodos empregando cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e cromatografia gasosa espectrometria de massa (GCMS) para medir marcadores bioquímicos de isquemia hipóxia neonatal. O sangue humano é usado para a maioria dos testes. Sangue animal também pode ser usado, reconhecendo o potencial de uricase gerado alantoína. Metabólitos de purinas estavam ligados à hipóxia já em 1963 ea confiabilidade de hipoxantina, xantina e ácido úrico como indicadores bioquímicos de hipóxia neonatal foi validada por vários pesquisadores 10-13. O método de HPLC utilizado para a quantificação de compostos de purina é rápido, confiável e reprodutível. O método de GC / MS utilizado para a quantificação de alantoína, um marcador relativamente novo de estresse oxidativo, foi adaptado de Gruber et al 7. Este método evita certos artefatos e requer baixos volumes de amostra. Métodos utilizados para a síntese de MMDA foram descritos em outros 14, 15. GC / MS com base quantificação de MDA foi adaptado a partir Paroni et al. e Cighetti et al. 16, 17. Xantina oxidase atividade foi medida por HPLC, quantificando a conversão de pterin para isoxanthopterin 18. Esta abordagem provou ser suficientemente sensível e reprodutível.
Protocol
Discussion
Os métodos descritos aqui permitir a avaliação da isquemia hipóxia neonatal. Este protocolo combina as medições de marcadores de privação de energia (ATP), stress oxidativo, dano oxidativo e atividade de enzimas para obter uma imagem global bioquímicos da presença ou até mesmo o grau de isquemia hipóxica. Apesar da utilidade deste método, existem limitações em potencial. Em primeiro lugar, que leva cerca de 1-2 ml de sangue para coletar plasma suficiente para executar todos os ensaios. Este não será um …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é financiado pelo National Institutes of Health NR011209 R01-03
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 6ml K3E EDTA K3 tube | Fisher Scientific | 2204061 | |
| 5702R centrifuge | Fisher Scientific | 05413319 | With 13&16MM adaptor |
| 1.5ml microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5599 | |
| 2-Aminopurine | Sigma-Aldrich | A3509 | |
| Varian Cary 100 spectrophotometer | Agilant Technologies | 0010071500 | |
| Savant SpeedVac | Thermo Scientific | SC210A-115 | |
| Micron centrifugal filter device | Fisher Scientific | UFC501596 | |
| Supelcosil LC-18-S Column | Sigma-Aldrich | 58931 | |
| Supelcosil LC-18-S Supelguard cartridge and holder | Sigma-Aldrich | 59629 | |
| HPLC | Waters | ||
| GCMS Vial | Fisher Scientific | 03376607 | |
| DL-Allantoin-5-13C;1-15N | CDN Isotopes | M-2307 | Lot #L340P9 |
| MTBSTFA | Thermo Scientific | 48920 | |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| 5973E GC/MSD | Agilent Technologies | G7021A | Part # for 5975E GC/MS |
| 3-Ethoxymethacrolein | Sigma-Aldrich | 232548 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Benzene | Sigma-Aldrich | 401765 | |
| Diisopropyl ether | Sigma-Aldrich | 38270 | |
| BHT | Sigma-Aldrich | B1378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Phenylhydrazine | Sigma-Aldrich | P26252 |
References
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