La medición bioquímica de la hipoxia neonatal
Summary
Se describe un método para medir los marcadores bioquímicos de la hipoxia-isquemia neonatal. El enfoque utiliza cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y cromatografía de gases espectrometría de masas (GC / MS).
Abstract
Isquemia hipoxia neonatal se caracteriza por una perfusión inadecuada de la sangre de un tejido o una sistemática falta de oxígeno. Esta condición se piensa que causa / exacerbar bien documentado trastornos neonatales entre ellas el deterioro neurológico 1-3. Disminución de la producción de trifosfato de adenosina se produce debido a la falta de fosforilación oxidativa. Para compensar este estado de energía privados moléculas que contienen enlaces de fosfato de alta energía son dos degradados. Esto lleva a mayores niveles de adenosina, que posteriormente se degrada a inosina, hipoxantina, xantina, y finalmente en ácido úrico. Los dos últimos pasos de este proceso de degradación se llevan a cabo por la xantina oxidorreductasa. Esta enzima existe en la forma de la xantina deshidrogenasa en condiciones normoxic pero se convierte en xantina oxidasa (XO) en circunstancias reperfusión hipoxia-4, 5. A diferencia de xantina deshidrogenasa, XO genera peróxido de hidrógeno como un subproducto de la degradación de purinas 4, 6. Este peróxido de hidrógeno en combinación con otras especies de oxígeno reactivo (ROS) se producen durante la hipoxia, oxida el ácido úrico a alantoína forma y reacciona con las membranas lipídicas para generar malondialdehído (MDA) 7-9. La mayoría de los mamíferos, los humanos exentos, poseen la enzima uricasa, que convierte el ácido úrico en alantoína. En los seres humanos, sin embargo, la alantoína sólo puede estar formado por ROS mediada por la oxidación del ácido úrico. Debido a esto, la alantoína se considera un marcador de estrés oxidativo en los seres humanos, pero no en los mamíferos que han uricasa.
Se describen los métodos que emplean cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y cromatografía de gases espectrometría de masas (GCMS) para medir los marcadores bioquímicos de isquemia hipoxia neonatal. La sangre humana se utiliza para la mayoría de las pruebas. Sangre de los animales también se puede utilizar sin dejar de reconocer el potencial de uricasa generado alantoína. Metabolitos de purinas estaban vinculados a la hipoxia en 1963 y la fiabilidad de hipoxantina, xantina y ácido úrico como indicadores bioquímicos de la hipoxia neonatal fue validada por varios investigadores 10-13. El método de HPLC utilizado para la cuantificación de los compuestos de purina es rápido, fiable y reproducible. El método de GC / MS utilizados para la cuantificación de alantoína, un marcador relativamente nuevo de estrés oxidativo, es una adaptación de Gruber et al 7. Este método evita ciertos artefactos y requiere un volumen bajo de la muestra. Los métodos utilizados para la síntesis de MMDA se describen en otros lugares 14, 15. GC / MS cuantificación base de MDA es una adaptación de Paroni et al. y Cighetti et al. 16, 17. Xantina oxidasa se midió por HPLC mediante la cuantificación de la conversión de pterina a isoxanthopterin 18. Este planteamiento resultó ser lo suficientemente sensibles y reproducibles.
Protocol
Discussion
Los métodos descritos aquí permiten la evaluación de la isquemia hipoxia neonatal. Este protocolo combina las mediciones de los marcadores de la energía (ATP) la privación, el estrés oxidativo, daño oxidativo, y la actividad enzimática para obtener una visión global de la bioquímica de la presencia o el grado de isquemia hipóxica. A pesar de la utilidad de este método, existen limitaciones potenciales. En primer lugar, es de unos 1-2 ml de sangre para obtener plasma suficiente para ejecutar todos los ensayos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo está financiado por los Institutos Nacionales de Salud NR011209 R01-03
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 6ml K3E EDTA K3 tube | Fisher Scientific | 2204061 | |
| 5702R centrifuge | Fisher Scientific | 05413319 | With 13&16MM adaptor |
| 1.5ml microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5599 | |
| 2-Aminopurine | Sigma-Aldrich | A3509 | |
| Varian Cary 100 spectrophotometer | Agilant Technologies | 0010071500 | |
| Savant SpeedVac | Thermo Scientific | SC210A-115 | |
| Micron centrifugal filter device | Fisher Scientific | UFC501596 | |
| Supelcosil LC-18-S Column | Sigma-Aldrich | 58931 | |
| Supelcosil LC-18-S Supelguard cartridge and holder | Sigma-Aldrich | 59629 | |
| HPLC | Waters | ||
| GCMS Vial | Fisher Scientific | 03376607 | |
| DL-Allantoin-5-13C;1-15N | CDN Isotopes | M-2307 | Lot #L340P9 |
| MTBSTFA | Thermo Scientific | 48920 | |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| 5973E GC/MSD | Agilent Technologies | G7021A | Part # for 5975E GC/MS |
| 3-Ethoxymethacrolein | Sigma-Aldrich | 232548 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Benzene | Sigma-Aldrich | 401765 | |
| Diisopropyl ether | Sigma-Aldrich | 38270 | |
| BHT | Sigma-Aldrich | B1378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Phenylhydrazine | Sigma-Aldrich | P26252 |
References
- Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites. J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).
- Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant-current concepts. Early Hum Dev. 80, 125-141 (2004).
- Webster, W. S., Abela, D. The effect of hypoxia in development. Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 215-228 (2007).
- Engerson, T. D., McKelvey, T. G., Rhyne, D. B., Boggio, E. B., Snyder, S. J., Jones, H. P. Conversion of xanthine dehydrogenase to oxidase in ischemic rat tissues. J Clin Invest. 79, 1564-1570 (1987).
- Choi, E. Y., Stockert, A. L., Leimkuhler, S., Hille, R. Studies on the mechanism of action of xanthine oxidase. J Inorg Biochem. 98, 841-848 (2004).
- Godber, B. L., Schwarz, G., Mendel, R. R., Lowe, D. J., Bray, R. C., Eisenthal, R. Molecular characterization of human xanthine oxidoreductase: the enzyme is grossly deficient in molybdenum and substantially deficient in iron-sulphur centres. Biochem J. 388, 501-508 (2005).
- Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations. Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).
- Zitnanova, I., Korytar, P., Aruoma, O. I., Sustrova, M., Garaiova, I., Muchova, J. Uric acid and allantoin levels in Down syndrome: antioxidant and oxidative stress mechanisms?. Clin Chim Acta. 341, 139-146 (2004).
- Siciarz, A., Weinberger, B., Witz, G., Hiatt, M., Hegyi, T. Urinary thiobarbituric acid-reacting substances as potential biomarkers of intrauterine hypoxia. Arch Pediatr Adolesc Med. 155, 718-722 (2001).
- Buonocore, G., Perrone, S., Longini, M., Terzuoli, L., Bracci, R. Total hydroperoxide and advanced oxidation protein products in preterm hypoxic babies. Pediatr Res. 47, 221-224 (2000).
- Berne, R. M. Cardiac nucleotides in hypoxia: possible role in regulation of coronary blood flow. Am J Physiol. 204, 317-322 (1963).
- Harkness, R. A., Lund, R. J. Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine, xanthine, uridine and inosine: high concentrations of the ATP metabolite, hypoxanthine, after hypoxia. J Clin Pathol. 36, 1-8 (1983).
- Plank, M. S., Boskovic, D. S., Sowers, L. C., Angeles, D. M. Biochemical markers of neonatal hypoxia. Pediatric Health. 2, 485-501 (2008).
- Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry. Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).
- Paroni, R., Fermo, I., Cighetti, G. Validation of methyl malondialdehyde as internal standard for malondialdehyde detection by capillary electrophoresis. Anal Biochem. 307, 92-98 (2002).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Ciuffreda, P., Allevi, P. Beta-ethoxyacrolein contamination increases malondialdehyde inhibition of milk xanthine oxidase activity. Free Radic Biol Med. 25, 818-825 (1998).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection. Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).
- Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).
- Fasman, G. . Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. , (1988).
- Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry. J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).
