Yenidoğan Hipoksi Biyokimyasal Ölçüm
Summary
Neonatal hipoksi-iskemi biyokimyasal belirteçler ölçmek için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yaklaşım, yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) ve Gaz Kromatografisi Kütle Spektrometresi (GC / MS) kullanmaktadır.
Abstract
Neonatal hipoksi iskemi yetersiz kan doku perfüzyon veya sistemik bir oksijen eksikliği ile karakterizedir. Bu durum neden / 1-3 nörolojik bozukluğu da dahil olmak üzere iyi belgelenmiş neonatal bozuklukları şiddetlendirebilir düşünülmektedir. Adenozin trifosfat üretiminin azalması, oksidatif fosforilasyon eksikliği nedeniyle oluşur. Bu enerji, yüksek enerjili fosfat bağının içeren yoksun devlet molekülleri telafi için bozulmuş 2 . Bu ve nihayet ürik asit, hipoksantin, ksantin inozin sonradan bozulmuş adenozin düzeylerinde artışa yol açar. Bu bozulma süreci son iki adımı ksantin oksiredüktaz tarafından yapılmaktadır. Bu enzim, normoksik koşullar altında ksantin dehidrogenaz formu var ancak hipoksi-reperfüzyon koşullar 4, 5 altında ksantin oksidaz (XO) dönüştürülür . Ksantin dehidrogenaz aksine, XO pürin bozulması 4, 6, bir yan ürün olarak hidrojen peroksit oluşturur. Hipoksi sırasında üretilen reaktif oksijen türleri (ROS), ile birlikte bu hidrojen peroksit, ürik asit, allantoin formu oksitler ve malondialdehit (MDA) 7-9 oluşturmak için lipid membranlar ile reaksiyona girer. Memeliler, çoğu insanlar muaf enzim uricase sahip allantoin, ürik asit dönüştürür. İnsanlarda, ancak, allantoin sadece ROS aracılı ürik asit oksidasyonu ile oluşan olabilir. Bu nedenle, allantoin uricase var memeliler insanlarda oksidatif stresin bir belirteci olarak kabul edilir ancak.
Biz neonatal hipoksi iskemi biyokimyasal belirteçler ölçmek için yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) ve gaz kromatografisi kütle spektrometresi (GCMS) istihdam yöntemleri açıklanmaktadır. İnsan kanı en testleri için kullanılır. Hayvan kan uricase oluşturulan allantoin için potansiyel kabul ederken de kullanılıyor olabilir. Pürin metabolitleri 1963 gibi erken olarak hipoksi ve hipoksantin, ksantin güvenilirliği ile bağlantılı olduğunu ve neonatal hipoksi biyokimyasal göstergeleri olarak ürik asit, bazı araştırmacılar 10-13 tarafından doğrulanmış oldu . Pürin bileşiklerin miktar tayini için kullanılan HPLC yöntemi, hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir. Allantoin, nispeten yeni bir oksidatif stres belirteci ölçümü için kullanılan GC / MS yöntemi, Gruber ve ark 7 uyarlanmıştır. Bu yöntem bazı eserler önler ve düşük miktarda örnek gerektirir. MMDA sentezi için kullanılan yöntemler, başka yerde 14 15 tarif edildi . GC / MS MDA tabanlı kantifikasyon Paroni ve ark uyarlanmıştır. Cighetti ve ark 16, 17. Ksantin oksidaz aktivitesi isoxanthopterin 18 pterin dönüşüm niceleme HPLC ile ölçüldü. Bu yaklaşım yeterince duyarlı ve tekrarlanabilir olduğunu kanıtladı.
Protocol
Discussion
Burada açıklanan yöntemler neonatal hipoksi iskemi değerlendirme izin. Bu protokol, varlığı bile genel bir biyokimyasal resim veya hipoksik iskemi derecesi kazanmak için enerji (ATP) yoksunluk, oksidatif stres, oksidatif hasarı ve enzim aktivitesi ölçümleri belirteçleri bir araya getiriyor. Bu yöntemin yararlarına rağmen, potansiyel sınırlamalar vardır. Öncelikle, tüm testleri çalıştırmak için yeterli plazma toplamak için yaklaşık 1-2 ml kan alır. Bu, yetişkin ya da çocuk bir sorun olmaz,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık R01 NR011209-03 Enstitüleri tarafından finanse edilmektedir
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 6ml K3E EDTA K3 tube | Fisher Scientific | 2204061 | |
| 5702R centrifuge | Fisher Scientific | 05413319 | With 13&16MM adaptor |
| 1.5ml microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5599 | |
| 2-Aminopurine | Sigma-Aldrich | A3509 | |
| Varian Cary 100 spectrophotometer | Agilant Technologies | 0010071500 | |
| Savant SpeedVac | Thermo Scientific | SC210A-115 | |
| Micron centrifugal filter device | Fisher Scientific | UFC501596 | |
| Supelcosil LC-18-S Column | Sigma-Aldrich | 58931 | |
| Supelcosil LC-18-S Supelguard cartridge and holder | Sigma-Aldrich | 59629 | |
| HPLC | Waters | ||
| GCMS Vial | Fisher Scientific | 03376607 | |
| DL-Allantoin-5-13C;1-15N | CDN Isotopes | M-2307 | Lot #L340P9 |
| MTBSTFA | Thermo Scientific | 48920 | |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| 5973E GC/MSD | Agilent Technologies | G7021A | Part # for 5975E GC/MS |
| 3-Ethoxymethacrolein | Sigma-Aldrich | 232548 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Benzene | Sigma-Aldrich | 401765 | |
| Diisopropyl ether | Sigma-Aldrich | 38270 | |
| BHT | Sigma-Aldrich | B1378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Phenylhydrazine | Sigma-Aldrich | P26252 |
References
- Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites. J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).
- Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant-current concepts. Early Hum Dev. 80, 125-141 (2004).
- Webster, W. S., Abela, D. The effect of hypoxia in development. Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 215-228 (2007).
- Engerson, T. D., McKelvey, T. G., Rhyne, D. B., Boggio, E. B., Snyder, S. J., Jones, H. P. Conversion of xanthine dehydrogenase to oxidase in ischemic rat tissues. J Clin Invest. 79, 1564-1570 (1987).
- Choi, E. Y., Stockert, A. L., Leimkuhler, S., Hille, R. Studies on the mechanism of action of xanthine oxidase. J Inorg Biochem. 98, 841-848 (2004).
- Godber, B. L., Schwarz, G., Mendel, R. R., Lowe, D. J., Bray, R. C., Eisenthal, R. Molecular characterization of human xanthine oxidoreductase: the enzyme is grossly deficient in molybdenum and substantially deficient in iron-sulphur centres. Biochem J. 388, 501-508 (2005).
- Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations. Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).
- Zitnanova, I., Korytar, P., Aruoma, O. I., Sustrova, M., Garaiova, I., Muchova, J. Uric acid and allantoin levels in Down syndrome: antioxidant and oxidative stress mechanisms?. Clin Chim Acta. 341, 139-146 (2004).
- Siciarz, A., Weinberger, B., Witz, G., Hiatt, M., Hegyi, T. Urinary thiobarbituric acid-reacting substances as potential biomarkers of intrauterine hypoxia. Arch Pediatr Adolesc Med. 155, 718-722 (2001).
- Buonocore, G., Perrone, S., Longini, M., Terzuoli, L., Bracci, R. Total hydroperoxide and advanced oxidation protein products in preterm hypoxic babies. Pediatr Res. 47, 221-224 (2000).
- Berne, R. M. Cardiac nucleotides in hypoxia: possible role in regulation of coronary blood flow. Am J Physiol. 204, 317-322 (1963).
- Harkness, R. A., Lund, R. J. Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine, xanthine, uridine and inosine: high concentrations of the ATP metabolite, hypoxanthine, after hypoxia. J Clin Pathol. 36, 1-8 (1983).
- Plank, M. S., Boskovic, D. S., Sowers, L. C., Angeles, D. M. Biochemical markers of neonatal hypoxia. Pediatric Health. 2, 485-501 (2008).
- Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry. Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).
- Paroni, R., Fermo, I., Cighetti, G. Validation of methyl malondialdehyde as internal standard for malondialdehyde detection by capillary electrophoresis. Anal Biochem. 307, 92-98 (2002).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Ciuffreda, P., Allevi, P. Beta-ethoxyacrolein contamination increases malondialdehyde inhibition of milk xanthine oxidase activity. Free Radic Biol Med. 25, 818-825 (1998).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection. Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).
- Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).
- Fasman, G. . Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. , (1988).
- Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry. J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).
