Biokemiska Mätning av neonatal Hypoxi
Summary
En metod beskrivs för att mäta biokemiska markörer för neonatal hypoxi-ischemi. Den metod som använder höga kromatografi Vätskekromatogram (HPLC) och gaskromatografi-masspektrometri (GC / MS).
Abstract
Neonatal hypoxi ischemi kännetecknas av otillräcklig blod perfusion av en vävnad eller en systemisk syrebrist. Detta villkor är tänkt att orsaka / förvärra väl dokumenterade neonatala sjukdomar, inklusive neurologisk försämring 1-3. Minskad adenosintrifosfat produktionen uppstår på grund av brist på oxidativ fosforylering. För att kompensera detta berövas molekyler energitillstånd med hög obligationer energi fosfat bryts ned 2. Detta leder till ökade nivåer av adenosin, som därefter bryts ned till inosin, hypoxantin, xantin, och slutligen till urinsyra. De två sista stegen i denna nedbrytande process utförs av xantin oxidoreductase. Detta enzym finns i form av xantin dehydrogenas i normoxic förhållanden men omvandlas till xantinoxidas (XO) under hypoxi-reperfusion omständigheter 4, 5. Till skillnad från xantin dehydrogenas, genererar XO väteperoxid som en biprodukt av purin nedbrytning 4, 6. Detta väteperoxid i kombination med andra reaktiva syreradikaler (ROS) som produceras under hypoxi, oxiderar urinsyra att bilda allantoin och reagerar med lipid membraner att generera malondialdehyd (MDA) 7-9. De flesta däggdjur, människan undantagna, har enzymet uricase, som omvandlar urinsyra till allantoin. Hos människa kan dock allantoin endast bildas av ROS-medierad oxidation av urinsyra. På grund av detta är allantoin anses vara en markör för oxidativ stress hos människor, men inte i däggdjur som har uricase.
Vi beskriver metoder för att anställa högt kromatografi Vätskekromatogram (HPLC) och gaskromatografi masspektrometri (GCMS) för att mäta biokemiska markörer av neonatal hypoxi ischemi. Människoblod används för de flesta tester. Djurens blod kan också användas samtidigt som potentialen för uricase genererade allantoin. Purin metaboliter var kopplade till hypoxi så tidigt som 1963 och tillförlitligheten på hypoxantin, xantin och urinsyra som biokemiska indikatorer på neonatal hypoxi bekräftades av flera utredare 10-13. HPLC-metod som används för kvantifiering av purin föreningar är snabb, pålitlig och reproducerbar. GC / MS-metod för kvantifiering av allantoin, en relativt ny markör för oxidativ stress, var anpassad från Gruber et al 7. Denna metod undviker vissa artefakter och kräver små mängder av provet. Metoder som används för syntes av MMDA beskrevs någon annanstans 14, 15. GC / MS kvantifiering av MDA anpassades från Paroni et al. och Cighetti et al. 16, 17. Xantinoxidas aktivitet mättes med HPLC genom att kvantifiera omvandlingen av pterin till isoxanthopterin 18. Detta tillvägagångssätt visade sig vara tillräckligt känsligt och reproducerbar.
Protocol
Discussion
De metoder som beskrivs här möjliggöra en utvärdering av neonatal hypoxi ischemi. Detta protokoll kombinerar mätning av markörer för energi (ATP) deprivation, oxidativ stress, oxidativ skada och enzymaktivitet att få en övergripande biokemiska bild av förekomsten eller graden av hypoxisk ischemi. Trots nyttan av denna metod, det finns potentiella begränsningar. För det första tar det ungefär 1-2 ml blod för att samla tillräckligt plasma att köra alla analyser. Detta kommer inte vara ett problem hos vuxn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansieras av National Institutes of Health R01 NR011209-03
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 6ml K3E EDTA K3 tube | Fisher Scientific | 2204061 | |
| 5702R centrifuge | Fisher Scientific | 05413319 | With 13&16MM adaptor |
| 1.5ml microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5599 | |
| 2-Aminopurine | Sigma-Aldrich | A3509 | |
| Varian Cary 100 spectrophotometer | Agilant Technologies | 0010071500 | |
| Savant SpeedVac | Thermo Scientific | SC210A-115 | |
| Micron centrifugal filter device | Fisher Scientific | UFC501596 | |
| Supelcosil LC-18-S Column | Sigma-Aldrich | 58931 | |
| Supelcosil LC-18-S Supelguard cartridge and holder | Sigma-Aldrich | 59629 | |
| HPLC | Waters | ||
| GCMS Vial | Fisher Scientific | 03376607 | |
| DL-Allantoin-5-13C;1-15N | CDN Isotopes | M-2307 | Lot #L340P9 |
| MTBSTFA | Thermo Scientific | 48920 | |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| 5973E GC/MSD | Agilent Technologies | G7021A | Part # for 5975E GC/MS |
| 3-Ethoxymethacrolein | Sigma-Aldrich | 232548 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Benzene | Sigma-Aldrich | 401765 | |
| Diisopropyl ether | Sigma-Aldrich | 38270 | |
| BHT | Sigma-Aldrich | B1378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Phenylhydrazine | Sigma-Aldrich | P26252 |
References
- Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites. J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).
- Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant-current concepts. Early Hum Dev. 80, 125-141 (2004).
- Webster, W. S., Abela, D. The effect of hypoxia in development. Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 215-228 (2007).
- Engerson, T. D., McKelvey, T. G., Rhyne, D. B., Boggio, E. B., Snyder, S. J., Jones, H. P. Conversion of xanthine dehydrogenase to oxidase in ischemic rat tissues. J Clin Invest. 79, 1564-1570 (1987).
- Choi, E. Y., Stockert, A. L., Leimkuhler, S., Hille, R. Studies on the mechanism of action of xanthine oxidase. J Inorg Biochem. 98, 841-848 (2004).
- Godber, B. L., Schwarz, G., Mendel, R. R., Lowe, D. J., Bray, R. C., Eisenthal, R. Molecular characterization of human xanthine oxidoreductase: the enzyme is grossly deficient in molybdenum and substantially deficient in iron-sulphur centres. Biochem J. 388, 501-508 (2005).
- Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations. Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).
- Zitnanova, I., Korytar, P., Aruoma, O. I., Sustrova, M., Garaiova, I., Muchova, J. Uric acid and allantoin levels in Down syndrome: antioxidant and oxidative stress mechanisms?. Clin Chim Acta. 341, 139-146 (2004).
- Siciarz, A., Weinberger, B., Witz, G., Hiatt, M., Hegyi, T. Urinary thiobarbituric acid-reacting substances as potential biomarkers of intrauterine hypoxia. Arch Pediatr Adolesc Med. 155, 718-722 (2001).
- Buonocore, G., Perrone, S., Longini, M., Terzuoli, L., Bracci, R. Total hydroperoxide and advanced oxidation protein products in preterm hypoxic babies. Pediatr Res. 47, 221-224 (2000).
- Berne, R. M. Cardiac nucleotides in hypoxia: possible role in regulation of coronary blood flow. Am J Physiol. 204, 317-322 (1963).
- Harkness, R. A., Lund, R. J. Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine, xanthine, uridine and inosine: high concentrations of the ATP metabolite, hypoxanthine, after hypoxia. J Clin Pathol. 36, 1-8 (1983).
- Plank, M. S., Boskovic, D. S., Sowers, L. C., Angeles, D. M. Biochemical markers of neonatal hypoxia. Pediatric Health. 2, 485-501 (2008).
- Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry. Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).
- Paroni, R., Fermo, I., Cighetti, G. Validation of methyl malondialdehyde as internal standard for malondialdehyde detection by capillary electrophoresis. Anal Biochem. 307, 92-98 (2002).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Ciuffreda, P., Allevi, P. Beta-ethoxyacrolein contamination increases malondialdehyde inhibition of milk xanthine oxidase activity. Free Radic Biol Med. 25, 818-825 (1998).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection. Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).
- Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).
- Fasman, G. . Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. , (1988).
- Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry. J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).
