Lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח In vivo</em
Summary
אנו מציגים טכניקה lentiviral מניפולציה גנטית להדמיה של האקסון נוירון יחיד חושי הריח arborization מסוף שלה<em> In vivo</em>.
Abstract
פיתוח מעגל חוש הריח המדויק מסתמך על תחזית מדויקת של חושי הריח נוירון (OSN) אקסונים מטרות הסינפטי שלהם הנורה חוש הריח (OB). מנגנונים מולקולריים של צמיחה האקסון OSN ומיקוד אינם מובנים היטב. ביטוי גנים מניפולציה ובעקבות חזותי של אקסונים OSN יחיד מסוף סוכת המורפולוגיה שלהם עד כה מאתגר. כדי לחקור תפקוד גנים ברמת תא בודד בתוך מסגרת הזמן המצוין, פיתחנו טכניקה המבוססת lentiviral לתפעל ביטוי גנים OSNs in vivo. חלקיקים lentiviral מועברות על ידי OSNs microinjection לתוך אפיתל ההרחה (OE). קלטות הביטוי אז הם משולבים באופן קבוע לתוך הגנום של OSNs transduced. חלבון הפלואורסצנט הירוק ביטוי מזהה OSNs נגוע מתאר מורפולוגיה כולו שלהם, כולל מסוף האקסון ארבור. בשל זמן אספקה קצר בין microinjection זיהוי כתב, תפקוד לימודי הגן יכול להיות ממוקד בתוך פרק זמן צר מאוד של פיתוח. באמצעות שיטה זו, יש לנו לזהות ביטוי של GFP בתוך כמה כמו שלושה ימים עוד שלושה חודשים לאחר ההזרקה. השגנו גם יתר ביטוי shRNA בתיווך עקום על ידי microinjection lentiviral. שיטה זו מספקת מורפולוגיות מפורט של גופים OSN התא אקסונים ברמת תא בודד in vivo, ובכך מאפשר אפיון של פונקציה מועמד גנים במהלך התפתחות חוש הריח.
Protocol
Discussion
Microinjection תוצאות lentivirus בהעברת קבע בונה גנים לתוך הדנ"א הגנומי OSN. גישה זו מאפשרת לנו לבצע מניפולציות לטווח קצר או לטווח ארוך של גנים מועמדים באמצעות overexpression או בתיווך shRNA עקום למטה. בנוסף, אנו יכולים fluorescently תווית OSNs יחיד בקו הקיים עכבר מהונדס לקיים שיתוף לוקליזציה של …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי NIH DC052256 ו DC006015, ו-NSF 0324769 עד QG ו-T32 DC008072 ל BS.
Materials
Microinjection: Newborn mice were microinjected using a 5μL Hamilton syringe (Hamilton #7647-01) fitted with a 33 gauge needle (Hamilton #7762-06).
Immunocytochemistry Reagents: Primary antibodies: rabbit polyclonal antibody GFP (Molecular Probes# A-6455), chicken polyclonal antibody against OMP (custom) (Chen et al., 2005), guinea pig polyclonal antibody against VGlut2 (Millipore# AB2251). Secondary antibodies: Cy2-conjugated donkey anti-rabbit (Jackson Immunolab# 711-225-152), Cy3-conjugated donkey-anti-chicken (Jackson Immunolab# 703-165-155) and Cy5-conjugated goat anti-guinea pig (Jackson Immunolab# 106-175-008). Sections were mounted on glass slides with Fluoromount G (Southern Biotech# 0010-01) with 50ng/mL DAPI chromatin stain solution.
Confocal Imaging: Z-stack images were taken using an Olympus Flouview FV1000 confocal microscope and images collected and processed into 3D projections using Olympus FV10-ASW 2.01 confocal acquisition and analysis software.
References
- Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor. J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).
- Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study. Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295, 868-872 (2002).
- Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo. J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).
