Lentivírus mediada Manipulação Genética e Visualização de Olfactory neurônios sensoriais In vivo</em

Summary

Nós apresentamos uma técnica lentiviral para a manipulação genética e visualização de axônio único neurônio olfactory sensoriais e sua arborização terminal<em> In vivo</em>.

Abstract

Desenvolvimento de um circuito precisa olfativa depende de projeção precisa de olfactory neurônio sensorial (OSN) axônios a seus alvos synaptic no bulbo olfativo (OB). Os mecanismos moleculares da OSN crescimento do axônio e segmentação não são bem compreendidos. Expressão do gene manipulação e posterior visualização dos axônios OSN solteiras e seus terminais morfologia arbor até agora têm sido um desafio. Para estudar a função dos genes ao nível única célula dentro de um prazo especificado, que desenvolveu uma técnica baseada lentiviral para manipular a expressão do gene em ORS in vivo. Partículas Lentivirus são entregues ORS por microinjeção no epitélio olfativo (OE). Cassetes de expressão são, então, permanentemente integrado no genoma da ORS transduzidas. Expressão da proteína fluorescente verde identifica ORS infectadas e delineia sua morfologia inteiro, incluindo o terminal axonal arbor. Devido ao tempo de resposta curto entre microinjeção e detecção de repórter, estudos da função do gene pode ser focado dentro de um período muito estreito de desenvolvimento. Com este método, nós temos detectado expressão GFP dentro de apenas três dias e até três meses após a injeção. Temos conseguido tanto a expressão mais e shRNA mediada knock-down por microinjeção lentiviral. Este método fornece morfologias detalhada dos corpos celulares e axônios OSN no nível da célula única in vivo e, portanto, permite a caracterização da função de genes candidatos durante o desenvolvimento olfativo.

Protocol

1. Preparação Este procedimento é de biossegurança nível 2, portanto, todas as seguintes preparações são feitas em uma cobertura de risco biológico, onde o procedimento de microinjeção é realizada. Preparar e pré-aquecimento a 37 ° C waterbed: Encha um saco de armazenamento de plástico com água – selo e fixado em um bloco de aquecimento esvaziado incubadora. Isso permitirá que os ratos se recuperar após a injecção. Encher um recipiente de res…

Discussion

Microinjeção de resultados lentivírus de transferência permanente de construções de gene em OSN DNA genômico. Essa abordagem nos permite realizar manipulações de curto prazo ou longo prazo de genes candidatos via superexpressão ou mediada shRNA knock-down. Além disso, podemos fluorescente ORS rótulo único em uma linha de rato transgênico existentes para observar co-localização das populações receptor de odorante. Microinjeção é necessário para a transdução lentiviral de ORS. Nós tentamos rubor s…

Materials

Microinjection: Newborn mice were microinjected using a 5μL Hamilton syringe (Hamilton #7647-01) fitted with a 33 gauge needle (Hamilton #7762-06).

Immunocytochemistry Reagents: Primary antibodies: rabbit polyclonal antibody GFP (Molecular Probes# A-6455), chicken polyclonal antibody against OMP (custom) (Chen et al., 2005), guinea pig polyclonal antibody against VGlut2 (Millipore# AB2251). Secondary antibodies: Cy2-conjugated donkey anti-rabbit (Jackson Immunolab# 711-225-152), Cy3-conjugated donkey-anti-chicken (Jackson Immunolab# 703-165-155) and Cy5-conjugated goat anti-guinea pig (Jackson Immunolab# 106-175-008). Sections were mounted on glass slides with Fluoromount G (Southern Biotech# 0010-01) with 50ng/mL DAPI chromatin stain solution.

Confocal Imaging: Z-stack images were taken using an Olympus Flouview FV1000 confocal microscope and images collected and processed into 3D projections using Olympus FV10-ASW 2.01 confocal acquisition and analysis software.