Lentivirus mediada por la manipulación genética y la visualización de las neuronas sensoriales olfativas In vivo</em

Summary

Se presenta una técnica de lentivirus de la manipulación genética y la visualización de un solo axón neuronas sensoriales olfativas y su arborización terminal de<em> In vivo</em>.

Abstract

Desarrollo de un circuito olfativo precisa se basa en la proyección exacta de las neuronas sensoriales olfativas (OSN), los axones hacia sus objetivos sináptica en el bulbo olfatorio (OB). Los mecanismos moleculares de la OSN crecimiento de los axones y la selección no se comprenden bien. Manipulación de la expresión génica y posterior visualización de los axones OSN único y su morfología terminal de jardín hasta el momento han sido todo un desafío. Para estudiar la función génica en el nivel de células individuales dentro de un plazo determinado, hemos desarrollado una técnica basada en lentiviral para manipular la expresión génica en OSN en vivo. Partículas lentiviral se entregan a OSN por microinyección en el epitelio olfatorio (EO). Casetes de expresión de forma permanente se integra en el genoma de la OSN transducidas. Expresión de la proteína fluorescente verde identifica OSN infectados y describe su morfología completa, incluido el jardín axón terminal. Debido a los plazos de entrega cortos entre la microinyección y la detección de periodista, los estudios de la función genética se puede enfocar en un plazo muy limitado de desarrollo. Con este método, se ha detectado la expresión de GFP en tan sólo tres días y hasta tres meses después de la inyección. Hemos logrado por la sobre-expresión y del shRNA mediada por knock-down por microinyección lentiviral. Este método proporciona morfologías detallada de los cuerpos celulares y axones OSN en el nivel de células individuales en vivo, y por lo tanto permite la caracterización de la función de genes candidatos durante el desarrollo del olfato.

Protocol

1. Preparación Este procedimiento es la bioseguridad de nivel 2, por lo tanto, todos los preparativos se hacen las siguientes en una campana de riesgo biológico donde se realiza el procedimiento de microinyección. Preparar y precalentamiento a 37 ° C cama de agua: Llene una bolsa de plástico con agua – sello y situado en un bloque vacío de calefacción incubadora. Esto permitirá que los ratones a recuperarse después de la inyección. Llenar un recipiente…

Discussion

Microinyección de lentivirus resultados en la transferencia permanente de construcciones de genes en el ADN genómico OSN. Este enfoque nos permite realizar manipulaciones a corto plazo oa largo plazo de genes candidatos a través de la sobreexpresión o mediados del shRNA knock-down. Además, se pueden etiquetar con fluorescencia OSN solo en una línea de ratones transgénicos existentes para observar la co-localización de las poblaciones de receptores odoríferos. Microinyección es necesaria para la transducción l…

Materials

Microinjection: Newborn mice were microinjected using a 5μL Hamilton syringe (Hamilton #7647-01) fitted with a 33 gauge needle (Hamilton #7762-06).

Immunocytochemistry Reagents: Primary antibodies: rabbit polyclonal antibody GFP (Molecular Probes# A-6455), chicken polyclonal antibody against OMP (custom) (Chen et al., 2005), guinea pig polyclonal antibody against VGlut2 (Millipore# AB2251). Secondary antibodies: Cy2-conjugated donkey anti-rabbit (Jackson Immunolab# 711-225-152), Cy3-conjugated donkey-anti-chicken (Jackson Immunolab# 703-165-155) and Cy5-conjugated goat anti-guinea pig (Jackson Immunolab# 106-175-008). Sections were mounted on glass slides with Fluoromount G (Southern Biotech# 0010-01) with 50ng/mL DAPI chromatin stain solution.

Confocal Imaging: Z-stack images were taken using an Olympus Flouview FV1000 confocal microscope and images collected and processed into 3D projections using Olympus FV10-ASW 2.01 confocal acquisition and analysis software.