Lentivirus की मध्यस्थता जेनेटिक और घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स के हेरफेर विज़ुअलाइज़ेशन Vivo में</em
Summary
हम आनुवंशिक और एकल घ्राण संवेदी न्यूरॉन अक्षतंतु के हेरफेर के दृश्य के लिए एक lentiviral तकनीक और अपने टर्मिनल arborization मौजूद<em> Vivo में</em>.
Abstract
एक सटीक घ्राण सर्किट के विकास घ्राण संवेदी न्यूरॉन घ्राण बल्ब (ओ) में उनके synaptic लक्ष्य (OSN) axons के सटीक प्रक्षेपण पर निर्भर करता है. OSN अक्षतंतु विकास और लक्ष्यीकरण के आणविक तंत्र को अच्छी तरह से समझ नहीं रहे हैं. चालाकी से जीन अभिव्यक्ति और एकल OSN axons और उनके टर्मिनल कुंज आकारिकी की visualizing के बाद इस प्रकार अब तक चुनौतीपूर्ण किया गया है. एक निर्धारित समय सीमा के भीतर एकल कोशिका के स्तर पर जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए, हम एक lentiviral आधारित vivo में OSNs में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर तकनीक विकसित की है. Lentiviral कणों microinjection द्वारा घ्राण उपकला (ँ) में OSNs करने के लिए वितरित कर रहे हैं. अभिव्यक्ति कैसेट तो स्थायी रूप से कर रहे हैं transduced OSNs के जीनोम में एकीकृत है. ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति संक्रमित OSNs को पहचानती है और उनके अक्षतंतु टर्मिनल कुंज सहित पूरे आकारिकी, रूपरेखा. Microinjection और रिपोर्टर का पता लगाने के बीच कम प्रतिवर्तन समय के कारण, जीन समारोह के अध्ययन के विकास के एक बहुत ही संकीर्ण अवधि के भीतर ध्यान केंद्रित किया जा सकता है. इस विधि के साथ, हम के रूप में कुछ के रूप में तीन दिनों के भीतर GFP अभिव्यक्ति का पता चला है और के रूप में लंबे समय के रूप में तीन महीने के इंजेक्शन के बाद. हम दोनों अभिव्यक्ति और shRNA lentiviral microinjection नीचे दस्तक मध्यस्थता हासिल किया है. इस विधि vivo में एकल कक्ष के स्तर पर OSN सेल निकायों और axons की विस्तृत morphologies प्रदान करता है, और इस प्रकार उम्मीदवार घ्राण विकास के दौरान जीन समारोह के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है है.
Protocol
Discussion
OSN जीनोमिक डीएनए में जीन constructs की स्थायी हस्तांतरण में lentivirus परिणाम के Microinjection. यह दृष्टिकोण हमें उम्मीदवार जीनों की overexpression या shRNA मध्यस्थता दस्तक नीचे के माध्यम से अल्पकालिक या दीर्घकालिक जोड़तोड़ प्रदर्शन ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन DC052256 NIH और DC006015, और Qg और बी एस T32-DC008072 0324769 NSF द्वारा समर्थित है.
Materials
Microinjection: Newborn mice were microinjected using a 5μL Hamilton syringe (Hamilton #7647-01) fitted with a 33 gauge needle (Hamilton #7762-06).
Immunocytochemistry Reagents: Primary antibodies: rabbit polyclonal antibody GFP (Molecular Probes# A-6455), chicken polyclonal antibody against OMP (custom) (Chen et al., 2005), guinea pig polyclonal antibody against VGlut2 (Millipore# AB2251). Secondary antibodies: Cy2-conjugated donkey anti-rabbit (Jackson Immunolab# 711-225-152), Cy3-conjugated donkey-anti-chicken (Jackson Immunolab# 703-165-155) and Cy5-conjugated goat anti-guinea pig (Jackson Immunolab# 106-175-008). Sections were mounted on glass slides with Fluoromount G (Southern Biotech# 0010-01) with 50ng/mL DAPI chromatin stain solution.
Confocal Imaging: Z-stack images were taken using an Olympus Flouview FV1000 confocal microscope and images collected and processed into 3D projections using Olympus FV10-ASW 2.01 confocal acquisition and analysis software.
References
- Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor. J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).
- Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study. Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295, 868-872 (2002).
- Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo. J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).
