A abordagem padrão para preparar adultos<em> Drosophila</em> Olhos para semi-fino de corte e análise microscópica de luz é apresentado aqui. O protocolo pode ser utilizado para análise morfológica bruta de defeitos olho, ou com os ajustes indicados podem ser usados para determinar os requisitos de genética de genes em tipos específicos de células do olho (por exemplo, a análise clonal de fotorreceptores) ou para a análise de microscopia eletrônica.
Drosophila tem sido muito utilizado como sistema modelo para estudar o desenvolvimento, principalmente devido à facilidade com que é geneticamente tratável. Ao longo dos anos, uma infinidade de cepas mutantes e truques técnicos foram desenvolvidos para permitir perguntas sofisticado para ser feita e respondida em um período razoável de tempo. Intuição fundamental para a interação dos componentes de todos os conhecidos principais vias de sinalização foi obtida em frente e verso, estudos genéticos Drosophila. O olho da mosca tem provado ser excepcionalmente adequado para análise mutacional, uma vez que, sob condições de laboratório, as moscas podem sobreviver sem os olhos funcionais. Além disso, a superfície do olho do inseto é composto por cerca de 800 olhos de cada unidade (facetas ou omatídeos) que formam uma superfície regular, lisa, quando observadas através de microscópio de dissecação. Assim, é fácil de ver se uma mutação poderia afetar o desenvolvimento do olho ou crescimento por externamente procurando a perda da superfície lisa (fenótipo "olho áspero"; Fig. 1.) Ou tamanho do olho em geral, respectivamente (para exemplos de telas com base em morfologia externa dos olhos ver, por exemplo 1). Subseqüentes análises detalhadas de fenótipos olho exigem a incorporação de fixação, de plástico e fino corte dos olhos dos adultos.
O olho Drosophila desenvolve a partir do disco olho chamados imaginal, um saco de células epiteliais que proliferam e se diferenciam durante as fases de larva e pupa (para revisão ver 2, por exemplo). Cada omatídeo consiste de 20 células, incluindo oito fotorreceptores (PR-R ou células;. Fig 2), quatro células secretoras de lentes de cone, células de pigmento ("hexágono" em torno de R célula-cluster) e uma cerda. Os fotorreceptores de cada omatídeo, mais facilmente identificados por suas organelas luz sensível, o rhabdomeres, são organizados em um trapézio formado por seis "exterior" (R1-6) e dois "interior" fotorreceptores (R7 / 8; R8 [Fig. . 2] é debaixo R7 e, portanto, só visto nas seções de áreas mais profundas do olho). O trapézio de cada faceta é precisamente alinhados com os dos seus vizinhos e os eixos ântero-posterior e geral dorsoventral do olho (Fig. 3A). Em particular, os omatídeos do dorsal e ventral (setas pretas e vermelhas, respectivamente) metades do olho são imagens de espelho um do outro e correspondem a duas formas quirais estabelecido durante sinalização de célula planar polaridade (para revisão ver, por exemplo 3).
O método para gerar seções semi-finas dos olhos (tais como aqueles apresentados na fig. 3) aqui descrito é ligeiramente modificada da que originalmente descrito por Tomlinson e pronto 4. Ele permite a análise morfológica de todas as células, exceto para as células cone transparente. Além disso, o pigmento da R-células (setas azuis na figura. 2 e 3) pode ser usado como um marcador de células autónomas para o genótipo de uma célula-R, necessidades assim genética de genes em um subconjunto de células-R pode ser facilmente determinada 5,6.
Utilizando Drosophila como modelo de organismo, telas genéticos levou à identificação de muitos dos membros fundadores de famílias de genes essenciais para a maioria das vias de sinalização altamente conservada em eucariotos superiores, incluindo os seres humanos. Uma vez que, sob condições de laboratório, um olho funcional é dispensável para a sobrevivência, o olho é um tecido particularmente adequado para a descoberta de novos genes e funções na avaliação de redes genéticas. A análise ultra-estrutural do olho da mosca utilizando o método descrito, assim, levou a descobertas fundamentais e relevantes para o desenvolvimento da doença. Inicialmente, a análise única célula clonal foi realizada utilizando clones de raios-X induzida combinada com a conhecida intimamente associada células autônomas marcadores recessivo. Mais recentemente, a disponibilidade do sistema FLP / FRT para gerar clones facilitou enormemente a análise fenotípica de mutações letais em seções olho 6,9.
Análise de seções olho não é limitado a secções tangenciais descrito aqui. Se desejar, as cabeças podem ser alinhados em qualquer orientação nos moldes e seções transversais podem ser obtidos para estudar as camadas mais profundas na cabeça, como a lâmina e medula. O protocolo aqui descrito é, portanto, um método versátil para análises dos olhos e da cabeça adultos estruturas Drosophila.
The authors have nothing to disclose.
Gostaria de agradecer ao Dr. Jennifer Curtiss para as fotos na fig. 1 e Jeremy Fagan e Dr. Florence Marlow pela leitura crítica do manuscrito. Nosso trabalho é apoiado pelo NIH conceder 1R01GM088202.
General equipment:
Fixation solutions:
Glutaraldehyde and OsO4 are highly toxic and should be handled with extreme care in a well-ventilated hood. Use filter tips when handling OsO4 to prevent blackening of your pipette.
Dehydration: Make 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, and 100% ethanol solutions. Preferably cool 30%, 50%, 70% ethanol on ice before use.
Staining solution:
1% Toluidine-blue in 1% Borax.
Soft | Hard | |
---|---|---|
Resin A | 54g | 50g |
Hardener B | 44.5g | 50g |
Accelerator C | 2.5g | 1.75g |
Plasticizer D | 10g | 0.75g |
Table 1. Resin preparation
To prepare the resin, carefully, but thoroughly mix all ingredients in a plastic beaker using a magnetic stirrer with a large stir bar. Avoid bubbles. After mixing, aliquot in standard scintillation vials or similar containers and freeze at -20°C. Use soft resin for all applications unless your EM facility asks for the harder formulation. Use gloves to handle resin (carcinogenic in its unpolymerized form). To polymerize resin on equipment and waste, bake at 70°C overnight. Waste may then be safely discarded and equipment cleaned and reused. Spilled unpolymerized resin can be cleaned with isopropanol.
Reagent | Supplier | Catalog number |
---|---|---|
Fly pad | e.g. Genesee | 59-119 |
Glutaraldehyde | Sigma | G7526-10 X 10 ML |
OsO4 | Polysciences,Inc. | 0972A-20 |
Propyleneoxide | Fisher | 04332-1 |
Scalpel handles, for #3 | Fisher | 22080046 |
Scalpel blades #11 | Fisher | 08-916-5B |
Transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M |
Durcupan (R) ACM resin | Sigma (Fluka) | 44610-1EA |
Steel dissecting needle | Fisher | S17346 |
BEEM flat embedding mold | Electron Microscopy Sci. | 70904-12 |
Teflon coated razor blades | Electron Microscopy Sci. | 71970 |
Q-tip (sterile swabs) | Fisher | 14-959-81 |
Glass slides | Fisher | 12-550-143 |
Cover slips No 1, 22X60 mm | Fisher | 12-531K |
Gelatin | Fisher | ICN96010280 |
Cr(III) K SO4 dodecahydrate | Sigma | 243361 |
Diamond Histo knife, 6mm | Diatome US | 60-His |
Toluidine Blue O | Fisher | BP107-10 |
Borax (Na-Tetraborate) | Fisher | AC20629-1000 |
DPX mounting medium | Sigma | 44581-100ML |
Table 2. Materials