Summary

عزل خلايا المناعة وظيفية القلب

Published: December 05, 2011
doi:

Summary

هذا الأسلوب لعزل الخلايا المناعية وظيفية من القلب ويوفر بديلا للأساليب التقليدية للكولاجيناز الهضم ، والذي يسبب تنشيط الخلايا المناعية غير المرغوب فيها ، مما أدى إلى انخفاض في استجابة هذه الخلايا. لدينا وسيلة لعزل الخلايا المناعية وظيفية غلة القلب عن طريق تجنب المشاكل المرتبطة الهضم الأنزيمي.

Abstract

الخلايا المناعية القلب تكتسب الفائدة على الدور الذي تلعبه في تغيير بنية مرضية في العديد من أمراض القلب 1-5 هذه الخلايا المناعية ، والتي تشمل الخلايا البدينة ، وخلايا تي الضامة ؛ تخزين وإطلاق مجموعة متنوعة من الوسطاء بما في ذلك النشطة بيولوجيا والسيتوكينات وقد ثبت البروتياز مثل تريبتاز 6-8 هؤلاء الوسطاء أن اللاعبين الرئيسيين في عملية الأيض المصفوفة خارج الخلية من خلال تفعيل metalloproteinases مصفوفة أو التسبب في تراكم الكولاجين بواسطة وظيفة القلب الليفية "تحوير 9-11 ومع ذلك ، التقنيات المتاحة لعزل الخلايا المناعية والقلب كانت مشكلة لأنها تستخدم كولاجيناز البكتيرية لهضم أنسجة عضلة القلب. هذا الأسلوب يؤدي تنشيط الخلايا المناعية وبالتالي فقدان وظائف. وضعنا على سبيل المثال ، تصبح الخلايا البدينة القلب بشكل ملحوظ أقل استجابة للمركبات التي تسبب تحبب (12). لذلك ، وهي تقنية تسمح للرانه عزل خلايا وظيفية قلبية المناعية التي من شأنها أن تؤدي إلى فهم أفضل لدور هذه الخلايا في أمراض القلب. 13 ، 14

يتطلب هذا الأسلوب في ألفة مع المكان التشريحي للفأر الخنجري الإبطين ، وعملية الرباط المنجلي ، وتأمور القلب. هذه هي معالم هامة لزيادة نجاح العملية وضمان عائدات أعلى من الخلايا المناعية في القلب. ويمكن بعد هذه الخلايا المناعية القلب المعزولة أن تستخدم لتوصيف النمط الظاهري ، وظائف ، والنضج ، وشارك في التجارب مع ثقافة خلايا القلب وغيرها للحصول على فهم أفضل لتفاعلاتها.

Protocol

1. إعداد هانكس "الرصيد محلول الملح (HBSS) الأوتوكلاف L 1 كوب الزجاج ، وتخرج 1000 مل اسطوانة ، ويحرك الشريط. إعادة الحل مسحوق HBSS تعقيمها في دورق زجاج 1 لتر إلى 900 مل علامة مع الماء المقطر مزدوجة. <…

Discussion

هذا الأسلوب من عزل الخلايا المناعية القلب تمكن من تحليل وظيفتها ، النمط الظاهري ، والنضج دون تفعيل غير المرغوب فيها التي تحدث عادة خلال التقليدية الأنزيمية الهضم تقنية العزل. متوسط ​​العدد الكلي للخلايا التي تم الحصول عليها مع هذا الأسلوب هو حوالي 400،000 في قلب فأ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل شركة ميرك UNCF – زمالة دراسات عليا بحوث العلوم أطروحة (JLM) ، القومي للقلب والرئة والدم المعهد منح RO1 – HL – 62228 (JSJ) وRO1 – HL – 073990 (JSJ).

Materials

Name of Reagent and Equipment Company Catalogue Number Comments
Hanks’ Balanced Salt Sigma H4891 One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt
Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt
Solution as a part of the procedure.
Antibiotic- Antimyotic Gibco 15240-062  
HEPES Sigma H3784  
Bovine Serum Albumin Sigma A3912  
250 mL Nalogene Filter Bottle Thermoscientific 157-0020  
12 N HCL Fisher Scientific CAS 7647-01-0 For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water.
10 N NaOH Fisher Scientific SC267 For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water.
Double Distilled Water      

Table of Specific Equipment:

Name of Reagent and Equipment Company Catalogue Number Comments
3-O Suture Silk Braided Ethicon Products SA64H  
Small Animal Ventilator CWE Incorporated SAR-830 Set breathing rate to 40.5 breaths per min.
Bevel 18 gauge needle BD Biosciences 305199 Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube.
Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter Baxter 2N111 Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4.
10 cc syringe Fisher Scientific 14-823-16B  
15 mL Falcon Tubes BD Biosciences 352097  
Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge Fisher Scientific 75-004-377 Remember to pre-cool and keep at 4°C.
Hyclone Thermoscientific S300030.02  
Hemocytometer Hausser Scientific HS-LB-1483  

References

  1. Brower, G. L., Chancey, A. L., Thanigaraj, S., Matsubara, B. B., Janicki, J. S. Cause and effect relationship between myocardial mast cell number and matrix metalloproteinase activity. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 283, H518-H525 (2002).
  2. Brower, G. L., Janicki, J. S. Pharmacologic inhibition of mast cell degranulation prevents left ventricular remodeling induced by chronic volume overload in rats. Journal of Cardiac Failure. 11, 548-556 (2005).
  3. Chancey, A. L., Brower, G. L., Janicki, J. S. Cardiac mast cell-mediated activation of gelatinase and alteration of ventricular diastolic function. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 282, H2152-H2158 (2002).
  4. Levick, S. P., Gardner, J. D., Holland, M., Hauer-Jensen, M., Janicki, J. S., Brower, G. L. Protection from adverse myocardial remodeling secondary to chronic volume overload in mast cell deficient rats. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43, 56-61 (2008).
  5. Levick, S. P., McLarty, J. L., Murray, D. B., Freeman, R. M., Carver, W. E., Brower, G. L. Cardiac Mast Cells Mediate Left Ventricular Fibrosis in the Hypertensive Rat. Hypertension. 53, 1041-1047 (2009).
  6. Batista, M. L., Santos, R. V., Cunha, L. M., Mattos, K., Oliveira, E. M., Seelander, M. C. Changes in the pro-inflammatory cytokine production and peritoneal macrophage function in rats with chronic heart failure. Cytokine. 34, 284-290 (2006).
  7. Galli, S. J., Tsai, M. Mast Cells: Versatile regulator of inflammation, tissue remodeling, host defense and homeostasis. Journal of Dermatological Science. 49, 7-19 (2008).
  8. Yndestad, A., Holm, A. M., Muller, F., Simonsen, S., Froland, S. S., Gullested, L. Enhanced expression of inflammatory cytokines and activation markers in T-cells from patients with chronic heart failure. Cardiovasc. Res. 60, 141-146 (2003).
  9. Bozkurt, B., Kribbs, S. B., Clubb, F. J., Michael, L. H., Didenko, V. V., Hornsby, P. J. Pathophysiologically Relevant Concentrations of Tumor Necrosis Factor-ɑ Promote Progressive Left Ventricular Dysfunction and Remodeling in Rats. Circulation. 97, 1382-1391 (1998).
  10. Frangogiannis, N. G., Lindsey, M. L., Michael, L. H., Youker, K. A., Bressler, R. B., Mendoza, L. H. Resident Cardiac Mast Cells Degranulate and Release Preformed TNF-ɑ, Initiating the Cytokine Cascade in Experimental Canine Myocardial Ischemia/Reperfusion. Circulation. 98, 699-710 (1998).
  11. Jobe, L. J., Melendez, G. C., Levick, S. P., Du, Y., Brower, G. L., Janicki, J. S. TNF-α inhibition attenuates adverse myocardial remodeling in a rat model of volume overload. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1462-H1468 (2009).
  12. Forman, M. F., Brower, G. L., Janicki, J. S. Spontaneous histamine secretion during isolation of rat cardiac mast cells. Inflammation Research. 53, 453-457 (2004).
  13. Levick, S. P., Murray, D. B., Janicki, J. S., Brower, G. L. Sympathetic nervous system modulation of inflammation and remodeling in the hypertensive heart. Hypertension. 55, 270-276 (2010).
  14. Morgan, L., Levick, S., Voloshenyuk, T., Murray, D., Forman, M., Brower, G. A novel technique for isolating functional mast cells from the heart. Inflammation Research. 57, 241-246 (2008).

Play Video

Cite This Article
McLarty, J. L., Meléndez, G. C., Spencer, W. J., Levick, S. P., Brower, G. L., Janicki, J. S. Isolation of Functional Cardiac Immune Cells. J. Vis. Exp. (58), e3020, doi:10.3791/3020 (2011).

View Video