Summary

בידוד של תאים חיסוניים פונקציונלית לב

Published: December 05, 2011
doi:

Summary

שיטה זו של בידוד תאים חיסוניים פונקציונלי מהלב מספק אלטרנטיבה בשיטות המקובלות של collagenase העיכול, מה שגורם לתא רצויות הפעלת המערכת החיסונית, וכתוצאה מכך תגובה לירידה של תאים אלה. השיטה שלנו של בידוד התשואות תפקודית תאים חיסוניים לב על ידי הימנעות בעיות הקשורות עיכול אנזימטי.

Abstract

תאים חיסוניים לב צוברים ריבית התפקידים שהם ממלאים שיפוץ הפתולוגי במחלות לב רבים 1-5 אלו תאים חיסוניים, הכוללים תא הפיטום, T-תאים מקרופאגים;. לאחסן ולשחרר מגוון של מתווכים פעילים ביולוגית כולל ציטוקינים פרוטאזות כמו tryptase. 6-8 מתווכים אלה הוכחו להיות שחקני מפתח מטבוליזם תאי מטריקס ידי הפעלת metalloproteinases מטריצה ​​או גרימת הצטברות קולגן על ידי פונקציית ויסות fibroblasts 'לב. 9-11 עם זאת, הטכניקות הזמינות עבור לבודד תאים חיסוניים יש לב היה בעייתי כי הם משתמשים collagenase חיידקי לעכל את רקמת שריר הלב. טכניקה זו גורמת להפעלה של תאים חיסוניים, ולכן אובדן תפקוד. לדוגמה, תא הפיטום לב להיות קשוב באופן משמעותי פחות תרכובות הגורמות degranulation. 12 לפיכך, אנו פיתחו שיטה המאפשרת tהבידוד של תפקודי לב תאים חיסוניים אשר יוביל להבנה טובה יותר של התפקיד של תאים אלה במחלת לב הוא. 13, 14

שיטה זו מחייבת היכרות עם המיקום האנטומי של xiphoid השחי של החולדה תהליך, רצועה falciform, ואת קרום הלב של הלב. ציוני דרך אלו חשובים כדי להגדיל את ההצלחה של ההליך כדי להבטיח תשואה גבוהה יותר של תאים חיסוניים לב. תאים אלו מבודדים החיסונית הלב יכול לשמש לאפיון הפנוטיפ של פונקציונליות, בגרות, ושיתוף תרבות ניסויים בתאי לב אחרים כדי להשיג הבנה טובה יותר של האינטראקציות שלהם.

Protocol

1. הכנת פתרון "הנקס מאזן מלח (HBSS) החיטוי 1 כוס כוס L, סיים את 1000 מ"ל גליל, ומערבבים בר. מחדש את אבקת פתרון HBSS את כוס L autoclaved 1 כוס לציון 900 מ"ל עם מים מזוקקים כפול. מ…

Discussion

שיטה זו של בידוד תאים חיסוניים לב מאפשר ניתוח של תפקידם, פנוטיפ, ובגרות ללא הפעלה לא רצויה, כי בדרך כלל מתרחשת במהלך טכניקה הבידוד המסורתי האנזימטית העיכול. המספר הכולל הממוצע של תאים שהושגו עם טכניקה זו היא בסביבות 400,000 דולר הלב העכברוש, מכתים דיפרנציאלי cytometry נית?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי UNCF-Merck בוגר עבודת מחקר מדעי Fellowship (JLM), הלאומי ללב, ריאות ודם המכון מענקים RO1-HL-62228 (JSJ) ו RO1-HL-073990 (JSJ).

Materials

Name of Reagent and Equipment Company Catalogue Number Comments
Hanks’ Balanced Salt Sigma H4891 One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt
Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt
Solution as a part of the procedure.
Antibiotic- Antimyotic Gibco 15240-062  
HEPES Sigma H3784  
Bovine Serum Albumin Sigma A3912  
250 mL Nalogene Filter Bottle Thermoscientific 157-0020  
12 N HCL Fisher Scientific CAS 7647-01-0 For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water.
10 N NaOH Fisher Scientific SC267 For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water.
Double Distilled Water      

Table of Specific Equipment:

Name of Reagent and Equipment Company Catalogue Number Comments
3-O Suture Silk Braided Ethicon Products SA64H  
Small Animal Ventilator CWE Incorporated SAR-830 Set breathing rate to 40.5 breaths per min.
Bevel 18 gauge needle BD Biosciences 305199 Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube.
Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter Baxter 2N111 Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4.
10 cc syringe Fisher Scientific 14-823-16B  
15 mL Falcon Tubes BD Biosciences 352097  
Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge Fisher Scientific 75-004-377 Remember to pre-cool and keep at 4°C.
Hyclone Thermoscientific S300030.02  
Hemocytometer Hausser Scientific HS-LB-1483  

References

  1. Brower, G. L., Chancey, A. L., Thanigaraj, S., Matsubara, B. B., Janicki, J. S. Cause and effect relationship between myocardial mast cell number and matrix metalloproteinase activity. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 283, H518-H525 (2002).
  2. Brower, G. L., Janicki, J. S. Pharmacologic inhibition of mast cell degranulation prevents left ventricular remodeling induced by chronic volume overload in rats. Journal of Cardiac Failure. 11, 548-556 (2005).
  3. Chancey, A. L., Brower, G. L., Janicki, J. S. Cardiac mast cell-mediated activation of gelatinase and alteration of ventricular diastolic function. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 282, H2152-H2158 (2002).
  4. Levick, S. P., Gardner, J. D., Holland, M., Hauer-Jensen, M., Janicki, J. S., Brower, G. L. Protection from adverse myocardial remodeling secondary to chronic volume overload in mast cell deficient rats. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43, 56-61 (2008).
  5. Levick, S. P., McLarty, J. L., Murray, D. B., Freeman, R. M., Carver, W. E., Brower, G. L. Cardiac Mast Cells Mediate Left Ventricular Fibrosis in the Hypertensive Rat. Hypertension. 53, 1041-1047 (2009).
  6. Batista, M. L., Santos, R. V., Cunha, L. M., Mattos, K., Oliveira, E. M., Seelander, M. C. Changes in the pro-inflammatory cytokine production and peritoneal macrophage function in rats with chronic heart failure. Cytokine. 34, 284-290 (2006).
  7. Galli, S. J., Tsai, M. Mast Cells: Versatile regulator of inflammation, tissue remodeling, host defense and homeostasis. Journal of Dermatological Science. 49, 7-19 (2008).
  8. Yndestad, A., Holm, A. M., Muller, F., Simonsen, S., Froland, S. S., Gullested, L. Enhanced expression of inflammatory cytokines and activation markers in T-cells from patients with chronic heart failure. Cardiovasc. Res. 60, 141-146 (2003).
  9. Bozkurt, B., Kribbs, S. B., Clubb, F. J., Michael, L. H., Didenko, V. V., Hornsby, P. J. Pathophysiologically Relevant Concentrations of Tumor Necrosis Factor-ɑ Promote Progressive Left Ventricular Dysfunction and Remodeling in Rats. Circulation. 97, 1382-1391 (1998).
  10. Frangogiannis, N. G., Lindsey, M. L., Michael, L. H., Youker, K. A., Bressler, R. B., Mendoza, L. H. Resident Cardiac Mast Cells Degranulate and Release Preformed TNF-ɑ, Initiating the Cytokine Cascade in Experimental Canine Myocardial Ischemia/Reperfusion. Circulation. 98, 699-710 (1998).
  11. Jobe, L. J., Melendez, G. C., Levick, S. P., Du, Y., Brower, G. L., Janicki, J. S. TNF-α inhibition attenuates adverse myocardial remodeling in a rat model of volume overload. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1462-H1468 (2009).
  12. Forman, M. F., Brower, G. L., Janicki, J. S. Spontaneous histamine secretion during isolation of rat cardiac mast cells. Inflammation Research. 53, 453-457 (2004).
  13. Levick, S. P., Murray, D. B., Janicki, J. S., Brower, G. L. Sympathetic nervous system modulation of inflammation and remodeling in the hypertensive heart. Hypertension. 55, 270-276 (2010).
  14. Morgan, L., Levick, S., Voloshenyuk, T., Murray, D., Forman, M., Brower, G. A novel technique for isolating functional mast cells from the heart. Inflammation Research. 57, 241-246 (2008).

Play Video

Cite This Article
McLarty, J. L., Meléndez, G. C., Spencer, W. J., Levick, S. P., Brower, G. L., Janicki, J. S. Isolation of Functional Cardiac Immune Cells. J. Vis. Exp. (58), e3020, doi:10.3791/3020 (2011).

View Video