Summary

Fonksiyonel Kardiyak Bağışıklık Hücreleri İzolasyon

Published: December 05, 2011
doi:

Summary

Bu yöntem kalp fonksiyonel bağışıklık hücrelerini izole etmek için, bu hücrelerin azalmış yanıt ile sonuçlanan istenmeyen bağışıklık hücre aktivasyonuna neden olur kollajenaz sindirim, geleneksel yöntemlere alternatif sunuyor. Izolasyon yöntemi, enzimatik sindirim ile ilgili sorunlar kaçınarak fonksiyonel kardiyak bağışıklık hücreleri elde edilir.

Abstract

Kardiyak bağışıklık hücreleri, birçok kalp hastalıkları patolojik remodeling oynadıkları roller için faiz kazanıyor mast hücreleri, T hücreleri ve makrofajlar 1-5 Bu bağışıklık hücreleri, depo ve sitokinler ve dahil olmak üzere çeşitli biyolojik olarak aktif mediatörlerin serbest triptaz olarak proteazlar 6-8 Bu aracılar, ekstraselüler matriks metabolizmasında anahtar oyuncular matriks metalloproteinazların aktive veya modüle kardiyak fibroblastlar 'fonksiyonu kollajen birikimi neden olduğu gösterilmiştir. 9-11 Bununla birlikte, kardiyak bağışıklık hücrelerini izole etmek için uygun teknikler var miyokard doku sindirimi bakteriyel kollajenaz kullanımı nedeniyle sorunlu olmuştur. Bu teknik, bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu ve böylece fonksiyon kaybına neden olur. Örneğin, kalp mast hücrelerinin degranülasyonu neden olan bileşiklerin önemli ölçüde daha az duyarlı hale gelir. 12 Bu nedenle, biz t sağlayan bir teknik geliştirdikalp hastalığı bu hücrelerin rolü daha iyi anlaşılmasına yol açacak fonksiyonel kardiyak bağışıklık hücrelerinin izolasyonu 13, 14

Bu yöntem, kalbin anatomik sıçan kılıç şeklinde süreci, koltuk altı ve orak şeklinde ligaman konumu ve perikard ile bir aşinalık gerektirir. Bu simge prosedürün başarısını artırmak ve kalp bağışıklık hücrelerini daha yüksek bir verim sağlamak için önemlidir. Bu izole kardiyak bağışıklık hücrelerini sonra, fenotip, olgunluk, ve diğer kalp hücreleri ile ko-kültür deneyler, bunların karşılıklı etkileşimi daha iyi bir anlayış kazanmak için karakterizasyonu için kullanılabilir.

Protocol

1. Hanks 'Balance Tuz Çözeltisi Hazırlama (HBSS) Otoklav 1 L cam beher, 1000 mL dereceli silindir, ve bar karıştırın. Çift distile su ile 900 mL işaretine otoklavlanmış 1 L cam beher HBSS toz çözüm sulandırın. HBSS çözüm 3.4 g HEPES Na + tuz ile karıştırın ve 7,35-7,41 arasında bir değer ya da konsantre HCL veya NaOH kullanılarak pH ayarlamak. Istenilen pH elde ve sabit kalır sonra 5 g, albümin, tamamen eriyene kadar oda sıcaklığında çözüm s…

Discussion

Kardiyak bağışıklık hücrelerini izole Bu yöntem genellikle enzimatik sindirimi geleneksel bir izolasyon tekniği sırasında ortaya çıkan istenmeyen aktivasyon olmadan bunların fonksiyonları, fenotip ve olgunluk analizi sağlar. Bu tekniği ile elde edilen hücrelerin ortalama toplam sayısı sıçan kalbinde başına 400.000 civarındadır ve bu hücrelerin diferansiyel boyama ve flow sitometri analizi, T-lenfositler (~% 70), makrofajlar (~% 12) ve mast hücreleri ile karışık bir nüfus olduğunu gösteri…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma bir UNCF-Merck Lisansüstü Bilim Araştırma Tezi Bursu (JLM), Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü hibe RO1-HL-62.228 (JSJ) ve RO1-HL-073.990 (JSJ) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name of Reagent and Equipment Company Catalogue Number Comments
Hanks’ Balanced Salt Sigma H4891 One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt
Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt
Solution as a part of the procedure.
Antibiotic- Antimyotic Gibco 15240-062  
HEPES Sigma H3784  
Bovine Serum Albumin Sigma A3912  
250 mL Nalogene Filter Bottle Thermoscientific 157-0020  
12 N HCL Fisher Scientific CAS 7647-01-0 For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water.
10 N NaOH Fisher Scientific SC267 For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water.
Double Distilled Water      

Table of Specific Equipment:

Name of Reagent and Equipment Company Catalogue Number Comments
3-O Suture Silk Braided Ethicon Products SA64H  
Small Animal Ventilator CWE Incorporated SAR-830 Set breathing rate to 40.5 breaths per min.
Bevel 18 gauge needle BD Biosciences 305199 Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube.
Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter Baxter 2N111 Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4.
10 cc syringe Fisher Scientific 14-823-16B  
15 mL Falcon Tubes BD Biosciences 352097  
Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge Fisher Scientific 75-004-377 Remember to pre-cool and keep at 4°C.
Hyclone Thermoscientific S300030.02  
Hemocytometer Hausser Scientific HS-LB-1483  

References

  1. Brower, G. L., Chancey, A. L., Thanigaraj, S., Matsubara, B. B., Janicki, J. S. Cause and effect relationship between myocardial mast cell number and matrix metalloproteinase activity. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 283, H518-H525 (2002).
  2. Brower, G. L., Janicki, J. S. Pharmacologic inhibition of mast cell degranulation prevents left ventricular remodeling induced by chronic volume overload in rats. Journal of Cardiac Failure. 11, 548-556 (2005).
  3. Chancey, A. L., Brower, G. L., Janicki, J. S. Cardiac mast cell-mediated activation of gelatinase and alteration of ventricular diastolic function. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 282, H2152-H2158 (2002).
  4. Levick, S. P., Gardner, J. D., Holland, M., Hauer-Jensen, M., Janicki, J. S., Brower, G. L. Protection from adverse myocardial remodeling secondary to chronic volume overload in mast cell deficient rats. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43, 56-61 (2008).
  5. Levick, S. P., McLarty, J. L., Murray, D. B., Freeman, R. M., Carver, W. E., Brower, G. L. Cardiac Mast Cells Mediate Left Ventricular Fibrosis in the Hypertensive Rat. Hypertension. 53, 1041-1047 (2009).
  6. Batista, M. L., Santos, R. V., Cunha, L. M., Mattos, K., Oliveira, E. M., Seelander, M. C. Changes in the pro-inflammatory cytokine production and peritoneal macrophage function in rats with chronic heart failure. Cytokine. 34, 284-290 (2006).
  7. Galli, S. J., Tsai, M. Mast Cells: Versatile regulator of inflammation, tissue remodeling, host defense and homeostasis. Journal of Dermatological Science. 49, 7-19 (2008).
  8. Yndestad, A., Holm, A. M., Muller, F., Simonsen, S., Froland, S. S., Gullested, L. Enhanced expression of inflammatory cytokines and activation markers in T-cells from patients with chronic heart failure. Cardiovasc. Res. 60, 141-146 (2003).
  9. Bozkurt, B., Kribbs, S. B., Clubb, F. J., Michael, L. H., Didenko, V. V., Hornsby, P. J. Pathophysiologically Relevant Concentrations of Tumor Necrosis Factor-ɑ Promote Progressive Left Ventricular Dysfunction and Remodeling in Rats. Circulation. 97, 1382-1391 (1998).
  10. Frangogiannis, N. G., Lindsey, M. L., Michael, L. H., Youker, K. A., Bressler, R. B., Mendoza, L. H. Resident Cardiac Mast Cells Degranulate and Release Preformed TNF-ɑ, Initiating the Cytokine Cascade in Experimental Canine Myocardial Ischemia/Reperfusion. Circulation. 98, 699-710 (1998).
  11. Jobe, L. J., Melendez, G. C., Levick, S. P., Du, Y., Brower, G. L., Janicki, J. S. TNF-α inhibition attenuates adverse myocardial remodeling in a rat model of volume overload. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1462-H1468 (2009).
  12. Forman, M. F., Brower, G. L., Janicki, J. S. Spontaneous histamine secretion during isolation of rat cardiac mast cells. Inflammation Research. 53, 453-457 (2004).
  13. Levick, S. P., Murray, D. B., Janicki, J. S., Brower, G. L. Sympathetic nervous system modulation of inflammation and remodeling in the hypertensive heart. Hypertension. 55, 270-276 (2010).
  14. Morgan, L., Levick, S., Voloshenyuk, T., Murray, D., Forman, M., Brower, G. A novel technique for isolating functional mast cells from the heart. Inflammation Research. 57, 241-246 (2008).

Play Video

Cite This Article
McLarty, J. L., Meléndez, G. C., Spencer, W. J., Levick, S. P., Brower, G. L., Janicki, J. S. Isolation of Functional Cardiac Immune Cells. J. Vis. Exp. (58), e3020, doi:10.3791/3020 (2011).

View Video