माउस Utero में Electroporation: नियंत्रित spatiotemporal जीन अभिकर्मक
Summary
एक अनूठी शल्य चिकित्सा पद्धति और इलेक्ट्रोड के विशेष आकार का उपयोग करके विकासशील माउस मस्तिष्क में एक जीन स्थानांतरण विधि वर्णित है. इस अनूठी तकनीक प्लाज्मिड अस्थायी और spatially डीएनए है, जो मस्तिष्क के विकास का अध्ययन में कई neuroscientists सहायता करेगा के अभिकर्मक की अनुमति देता है.
Abstract
In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.
Protocol
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम केवल एक छोटे से भ्रूण मस्तिष्क के अलग आकार इलेक्ट्रोड का उपयोग प्रतिबंधित क्षेत्र में pCAG – EYFP अभिकर्मक की तकनीक के लाभों का वर्णन. के लिए अभिकर्मक दक्षता के विभिन्न प्रमोटर द्वारा तुलना पहले से वर्णित है, जो सेल प्रकार एक विशिष्टता से पता चलता है. हालांकि, वहाँ अभिकर्मक के रूप में ऐसी तकनीक के लिए सीमाएं हैं केवल क्षणिक है और प्लाज्मिड पर निर्भर बदलता है, यह किसी भी सेल विशिष्टता नहीं है और यह ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की संख्या पर नियंत्रण कठिन है. ThereforeHowever, अन्य तकनीकों के साथ इस प्रोटोकॉल के संयोजन आगे अलग हेरफेर तरीकों के लिए संभावनाओं प्रदान करेगा. सबसे पहले, प्लास्मिड डीएनए में सेल विशिष्ट प्रमोटर शामिल सेल प्रकार न्यूरॉन्स, glial कोशिकाओं और astrocytes जैसे विशिष्ट अभिकर्मक, की अनुमति देगा. दूसरा, के बाद से अभिकर्मक क्षणिक है, यह वैज्ञानिकों ने बाद में जीवन में जीन के समारोह का विश्लेषण करना चाहते हैं के लिए उपयुक्त नहीं है. इसलिए, प्लास्मिड डीएनए जीनोम में एकीकृत transposase के साथ संयोजन यह एक स्थिर 8 अभिकर्मक में बदल जाएगा . Tet पर या tet बंद प्रणाली के अगले गोद लेने, यह संभव समय या तंत्रिका कोशिकाओं 8 में टाइप विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति सेल हेरफेर करने के लिए कर देगा. वैकल्पिक रूप से, एक tamoxifen-inducible (टी) Cre ईआर 9 recombinases और रिपोर्टर 10 चूहों के साथ इस प्रोटोकॉल गठबंधन कर सकते हैं.
ऊतकों के इस व्यापक पहुंच काफी तंत्रिका विज्ञान में प्रयोग किया जाता प्रयोगात्मक डिजाइन बदल जाएगा.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम आरआईकेईएन मस्तिष्क विज्ञान संस्थान (बीएसआई), मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम (HFSP) (टीएस के लिए सम्मानित किया गया) और आरआईकेईएन जूनियर रिसर्च एसोसिएट कार्यक्रम (JRA, एम.के. के लिए सम्मानित किया) आरआईकेईएन मस्तिष्क विज्ञान संस्थान (बीएसआई), मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया था (HFSP) (टीएस करने के लिए सम्मानित किया गया) और आरआईकेईएन जूनियर रिसर्च एसोसिएट कार्यक्रम (JRA, एम.के. को सम्मानित किया) यह काम वित्त पोषित.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| bare tungsten wire diameter 125 μm | A-M systems | 797600 |
| bare platinum wire diameter 125 μm | A-M systems | 767000 |
| Stick electrodes | Nepa gene | CUY610P4-1 |
| glass capillary tube | Stoelting | 50611 |
| micromanipulator | KD Scientific | KDS310 |
| scissors | ROBOZ | RS-5865 |
| pulse generator | A-M Systems | Model 2100 |
| 9 mm autoclip | ROBOZ | RS-9260 |
| gold-plated pins | WPI | 5482 |
| RORc antibody | Perseus Proteomics | H3925 |
References
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