הכינון ביוכימיים של קולטן סטרואידים • Hsp90 קומפלקסים חלבונים ו מחדש של ליגנד הכבילה
Summary
<em> במבחנה</em> שיטה להכנת קולטן glucocorticoid תפקודית (GR) • Hsp90 קומפלקסים חלבונים מטוהרים מן חלבונים lysates הסלולר מתואר. השיטה משתמשת immunoadsorption של GR רקומביננטי ואחריו מלח הפשטת והרכבתה מחדש חלבון מורכב. חשיבותה של cofactors ותנאי חיץ נדונים, כמו גם יישומים שיטת פוטנציאליים.
Abstract
Hsp90 הוא חלבון חיוני ורב מאוד המלווה המולקולרי נמצא להסדיר יותר מ 150 חלבונים איתות אוקריוטים, כולל גורמי תעתוק (קולטנים גרעיני למשל, p53) ו קינאזות חלבון (למשל Src, רף, Akt קינאז) מעורב אופניים התא, tumorigenesis, אפופטוזיס, וכן מספר רב של מסלולים 1,2 אוקריוטים איתות. רבים מבין אלה חלבונים "לקוח" עבור Hsp90, ההרכבה של קולטן סטרואידים • Hsp90 מתחמי הוא הטוב ביותר מוגדר (איור 1). אנו מציגים כאן קולטן glucocorticoid להתאמה (GR) assay immunoprecipitation ו במבחנה GR • Hsp90 שיטה הכינון מחדש כי ניתן להשתמש בקלות לחקור פעילות אוקריוטים Hsp90 פונקציונלי, Hsp90 בתיווך ליגנד רצפטור סטרואידים מחייב, מולקולרית cofactor דרישות המלווה. לדוגמה, assay זה יכול לשמש כדי לבדוק את דרישות Hsp90 cofactor ואת ההשפעות של הוספת מרכיבים חיצוניים לתהליך הכינון מחדש.
GR כבר מערכת שימושית במיוחד ללימוד Hsp90 כי הקולטן חייב להיות מאוגד Hsp90 יש מחייב ליגנד פתוח שסוע הנגיש 3 סטרואידים. GR אנדוגני, unliganded נמצא בציטופלסמה של בתאי יונקים מחויב noncovalently כדי Hsp90. מצאו כמו GR אנדוגני • Hsp90 heterocomplex, ליגנד GR מחייב שסוע פתוח מסוגל סטרואידים מחייב. אם Hsp90 מנתק מ GR, או אם תפקידה הוא עכבות, הקולטן אינו מסוגל להיקשר סטרואידים דורש הכינון מחדש של GR • Hsp90 heterocomplex לפני פעילות מחייב סטרואידים משוחזר 4. GR ניתן immunoprecipitated מ cytosol התא באמצעות נוגדן חד שבטי, וחלבונים כגון Hsp90 ומורכבת כדי GR ניתן assayed ידי כתם המערבי. פעילות מחייב סטרואידים של GR immunoprecipitated ניתן לקבוע על ידי דוגרים immunopellet עם [3 ח] סטרואידים.
ניסויים קודמים הראו Hsp90 בתיווך הפתיחה של הכריכה GR ליגנד שסוע מחייב hsp70, המלווה המולקולרי second חיוני גם כדאיות התא האיקריוטים. פעילות ביוכימית של Hsp90 ו hsp70 הם catalyzed ידי הופ חלבונים שיתוף המלווה, hsp40, 5 ו – p23. המלווה multiprotein מכונות המכיל Hsp90, הופ hsp70, ו hsp40 הם endogenously הנוכחית בציטופלסמה תא אוקריוטים, ו lysate reticulocyte מספק המלווה עשירים מקור חלבון 6.
בשיטה הציג, GR הוא immunoadsorbed מ cytosol התא הפשיטו של מכונות המלווה אנדוגני hsp90/hsp70 באמצעות תנאים מלח קל. GR הפשיטו מלח הוא מודגרות אז עם lysate reticulocyte, ATP, ו-K +, שתוצאתה הכינון מחדש של GR • Hsp90 heterocomplex ו מחדש של פעילות מחייב סטרואידים 7. שיטה זו יכולה להיות מנוצל כדי לבדוק את ההשפעות של cofactors המלווה שונים, חלבונים רומן, וניסיוני מעכבי Hsp90 או GR כדי לקבוע משמעות תפקודית שלהם על Hsp90 בתיווך 8-11 מחייב סטרואידים.
Protocol
Discussion
Assay שתוארו לעיל ניתן להתאים מבחן מספר עצום של מצבים המשפיעים על פעולות המלווה של המנגנון המלווה hsp90/hsp70-based וכן מחייב GR סטרואידים. זהו שינוי של שיטות 4,8,9,17 שדווח קודם לכן, והוא נועד לנצל את ההתקדמות בטכנולוגיה אלקטרופורזה ולהיות נגיש לקהילה מחקר רחב יותר. Cofactors נוס…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק GM086822, מקווה לב מכון פרס יסוד מדעי, ואת מרדוק MJ מחקר הצדקה אמון מכללת התוכנית למדע. בחר ריאגנטים אלקטרופורזה וניתוח תוכנה תמונה סופקו בנדיבות על ידי Bio-Rad.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Sf9 insect cells | Invitrogen | for baculovirus expression of recombinant mouse GR | |
| L929 cells | ATCC | CRL-2173 | for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression) |
| FiGR hybridoma cells | ATCC | CRL-2173 | for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody) |
| Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free | Roche Applied Science | 11836170001 | |
| protein A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| rabbit reticulocyte lysate | Green Hectares (Oregon, WI) | rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery | |
| creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | for ATP-regenerating system |
| phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | for ATP-regenerating system |
| anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) | Pierce/Thermo Scientific | MA1-510 | used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | used as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | used as primary antibody in western blotting |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | 038K7690 | used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption |
| anti-mouse IgG-peroxidase conjugate | Sigma-Aldrich | A4416 | used as secondary antibody in western blotting |
| Experion microfluidic electrophoresis system | Bio-Rad | 7007001 | alternative to conventional SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7-3H] dexamethasone | PerkinElmer | NET1192001MC | follow safety precautions |
References
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).
- Murphy, P. J. M. Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention. Leukemia. 19, 710-712 (2005).
- Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts. J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).
- Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. Reconstitution of the steroid receptor•hsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).
- Morishima, Y. The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system. J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).
- Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).
- Dittmar, K. D., Pratt, W. B. Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation. J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).
- Kanelakis, K. C. Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery. J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).
- Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes. 생화학. 40, 1109-1116 (2001).
- Murphy, P. J. M. Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation. J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. Stepwise assembly of a glucocorticoid receptor•hsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket. J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones. Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).
- Bodwell, J. E. Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor. J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).
- Penna, A., Cahalan, M. W. e. s. t. e. r. n. Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).
- Choo, Y. S., Zhang, Z. Detection of Protein Ubiquitination. J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).
- Murphy, P. J. M. Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor•Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft. J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).
- Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR). Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).
- Cintron, N. S., Toft, D. Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway. J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).
