신경 전구체 이식은 보호 및 / 또는 척수 상해 (SCI)과 모터 신경 장애, amyotrophic 패스 경화증 (ALS)에 분실 / 역기능 자궁 phrenic 모터 뉴런을 교체 유망 전략이다. 우리는 ALS와 SCI의 쥐 모델에서 자궁 경부 척수 복부 혼까지 셀 전송을위한 프로토콜을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
phrenic 모터 신경 세포의 손실로 인해 호흡기 손상은 인간의 외상성 척수 손상의 큰 비율 (SCI) 가지 경우 1 쇠약 결과이며, 모터 신경 장애, amyotrophic 패스 경화증 (ALS) 2 환자에서 사망의 궁극적인 원인입니다.
ALS는 상부의 비교적 빠른 변성 낮은 모터 뉴런이 특징입니다 치명적인 신경 질환이다. 평균 2-5년에있는 질병에 궁극적으로 쓰러지는 환자 때문에 횡경막 3 phrenic 모터 신경 세포의 innnervation의 손실로 인해 호흡 마비의 진단에 따라. 10 % 가족성 양식의하는 동안 대부분의 경우는 산발하고 있습니다. 가족성 가지 경우 대략 20 %가 염색체 21 4 잘라내기 / Zn 초과 산화물 dismutase 1 (SOD1) 유전자의 다양한 돌연변이 포인트로 연결되어 있습니다. 돌연변이 인간 SOD1 유전자를 (G93A, G37R, G86R, G85R) 운반 유전자 변형 마우스 4,5와 쥐 6 생성하고, 모터 신경 세포의 손실을 다른 동물 모델의 존재에도 불구하고, 현재이 질병의 가장 높은 사용 모델 아르되었습니다 .
척수 손상 (SCI)는 부상 7 종류, 위치 및 심각도에 따라 다양한 기능과 실제 결과 외상에서 척수에 발생하는 조건의 이질적인 집합입니다. 그럼에도 불구하고, 인간의 SCI 케이스의 약 절반으로 인해 phrenic 모터 신경 세포 손실 및 bulbospinal의 호흡 axons 1 내림차순으로 부상을 쇠약하게 호흡 부전의 결과, 자궁 지역에 영향을 미칩니다. SCI의 동물 모델의 숫자는 가장 일반적으로 사용하고 임상 - 관련 타박상 8되는, 개발되었습니다.
신경 전구체 세포 (NPCs)의 다양한 클래스의 이식 때문에 분실 또는 역기능 CNS 세포 종류가 제공하는 neuroprotection를 교체하고, 유전자 요인을 제공할 수있는 능력의 ALS 및 SCI를 포함한 외상 CNS의 부상과 neurodegeneration의 치료를위한 유망한 치료 전략 관심 9.
ALS와 SCI 모두의 동물 모델 phrenic 모터 신경 세포 손실 및 결과의 호흡기 손상 10,11 포함하여이 질병의 많은 임상 - 관련 측면을 모델 수 있습니다. ALS와 SCI 이러한 동물 모델에서 호흡 기능에 NPC 기반 전략의 효능을 평가하기 위해서는 세포 개입은 특히 phrenic 모터 뉴런과 같은 therapeutically 관련 목표를 포함하는 지역으로 이동해야합니다. 우리는 이러한 SOD1 G93A 마우스 및 쥐뿐만 아니라 척수 부상 쥐 및 쥐 11으로 neurodegenerative 모델의 자궁 경부 척수 복부 회색 물질로 NPCs의 멀티 segmental, intraspinal 이식에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다.
프로토콜
방법
1. 셀 준비
예를 들어, 우리는 이것 때문에 세포 유형과 경험의 이식에 대한 glial 전구 세포에게 12 준비 절차를 설명합니다. 그러나, 중간 및 예를 들어, 트립신의 사용을 포함한 프로토콜의 세부 사항은, 이식에 사용되는 특정 세포 종류에 따라 달라집니다.
- 37.0 미리 따뜻한 모든 솔루션 ° C 물 목욕 인치
- HBSS로 플라스크의 2X를 헹굴. 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5.0 mL/T-75 플라스크를 추가합니다. 37.0 ° C 배양기에서 3 분 플라스크를 품어. 5 10mL 피펫과 플라스크에 부드럽게 배 씹다.
옵션 : 1.0 MG / DMEM/F12에 ML의 대두 트립신 억제제의 추가 5.0 mL/T-75 술병.
- 매체의 5.0 ML 각 플라스크에 2X를 헹굴. 수영장 세포와 물에 빨고. 이후의 모든 단계를 얼음에 세포 보관하십시오.
- 원뿔 관에서 5 분 200-300그램에 스핀 : 선호 원심 분리기 관련 4 냉각 ° C. 가만히 따르다 (저장) 뜨는. 매체의 1....
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토론
SOD1 G93A 마우스 및 쥐, 연령 및 그룹 내에서 동물을 섹스와 일치하고, 다른 그룹에 동일한 쓰레기 내에 동물을 배포합니다. 관련된 연구 그것은 질병 프로세스가 남성과 여성 사이에 다를 수 있기 때문에 ALS와 SCI 모델 모두에 대해 동일한 성별의 모든 동물을 사용하는 것이 바람직하지만, 그것은 또한 가능한 섹스 특정 효과를 감지하는 두 남녀의 충분한 동물을 가지고하는 것이 유용할 수 있습니다대로 이러한 현상은 SOD1 G93A의 쥐 13 SOD1 G93A 마우스 14,15로보고되었습니다. 동물에 세포 이식을위한 세 / 질병의 포인트 (ALS 동물) 또는 시간 후 부상을 (SCI 모델)을 고려하십시오. 이 전략은 가능성이 해결되는 특정 세포 메커니즘에 따라 달라질 것이다.
프로토콜은 여기에 설명된 쥐, 마우스 경추 척추 코드 11,뿐만 아니라 흉부 및 요추 수준
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
나는 감사의 말씀을 전합니다 : Lepore의 모든 구성원, Maragakis 및 도움이 토론 Rothstein 연구소, 미국과 자금에 대한 크랙 H. Neilsen 재단의 굳는 베테랑.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| HBSS | Gibco | 14,170 | |
| 0.05 %의 트립신 | Gibco | 25,300 | |
| 대두 트립신 억제제 (선택 사항) | 시그마 | T - 6522 | |
| Acepromazine의 maleate (0.7 밀리그램 / kg) | Fermenta 동물 건강 | ||
| 케타민을 (95 MG / kg) | 포트 닷지 동물 건강 | ||
| Xylazine (10 MG / kg) | 바이엘 | ||
| # 11 깃털 외과 블레이드 | 전자 현미경 과학 | 72044-11 | |
| 면과 밀고 applicators (6 인치) | 어부 | 23-400-101 | |
| 쥐 - 톱니 포셉 | 파인 과학 도구 | 쥐 : 11023-15; 마우스 : 11042-08 | |
| 중간 크기의 스프링 가위 | 파인 과학 도구 | 15012-12 | |
| 미니 스프링 가위 | 파인 과학 도구 | 15000-10 | |
| Rongeur | 파인 과학 도구 | 쥐 : 16121-14; 마우스 : 16221-14 | |
| Microknife | 파인 과학 도구 | 10056-12 | |
| 니들 홀더 | 파인 과학 도구 | 12502-14 | |
| 봉합 : 4-0 | Vicryl | S - 183 | |
| 스테이플 : 9mm | Autoclip | 427631 | |
| 스테플러 : 9mm (목표 # 203-1000) | 세계 정밀 계측기 | 5,000,344 | |
| 온수 펌프 (T / 펌프) | Gaymar | P / N 07999-000 | |
| 시클 로스 포린 A : 250.0 mg/5.0 ML의 ampules | 노바티스 / Sandimmune | NDC 0078-0109-01 | |
| FK - 506 | LC 연구소 | F - 4900 | |
| Rapamycin | LC 연구소 | R - 5000 | |
| 주사기 | 세계 정밀 계측기 | UMP2 | |
| 마이크로 네 Microsyringe 펌프 컨트롤러 | 세계 정밀 계측기 | UMC4 | |
| Micromanipulator | 세계 정밀 계측기 | 연 - R | |
| 10.0 μL 해밀턴 주사기 | 해밀턴 | 80,030 | |
| 해밀턴 바늘 : 33 게이지, 45 ° 베벨, 1 인치 | 해밀턴 | 7803-05 | |
| 유리 20.0 μL microcapillary pipettes (선택 사항) | 킴블 | 71900-20 |
참고문헌
- Lane, M. A., Fuller, D. D., White, T. E. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Trends in neurosciences. 31, 538-538 (2008).
- Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin. Chest. Med. 15, 675-675....
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재인쇄 및 허가
