사람의 체외에서 억제

Summary

Tregs는 면역 시스템의 강력한 진압하고 있습니다. 그들을 정의하는 독특한 표면 마커의 부족이있다, 그러므로, Tregs의 정의는 주로 기능입니다. 여기서 우리는 최적화된 설명을 체외에서 검정.

Abstract

규제 T 세포 (Tregs)는 자기 항원에 면역 관용의 중요한 중재자입니다. 또한, 그들은 다음과 같은 감염 면역 반응의 중요한 규제하고 있습니다. Tregs의 독특한 표면 마커를 식별할 수 있도록 노력에도 불구하고, 유일한 고유 기능은 효과기 T 세포의 증식과 기능을 억제하는 능력이다. 그것은 체외의 assays 인간의 Treg의 기능을 평가에서 사용할 수있는 것이 분명이지만 건강한 세포와 세포가자가 면역 질환 (제 1 형 당뇨병 - T1D 등) 필요로하는 과목에서 격리 교차 단면 연구의 결과를 평가하면,이 문제가됩니다 비교합니다. 응답 비율과 항원 제시 세포의 수와 유형 (APC)는 체외 억제의 assays 인간의 사용 : 응답 T 세포, 자극의 자연과 강도, Treg의 수와 유형 실험실 사이 큰 변화가있다. 이 변화는 Treg 함수가 어려운 측정 연구 사이의 비교를합니다. Treg 필드는 건강한 과목과 면역 질환있는 사람 모두 잘 작동하는 표준 억제 분석이 필요합니다. 우리는 췌장 β - 세포의 면역 파괴를 기본과 과목에 비해 건강한 지원자에서 격리 T 세포의 자극에 아주 작은 내부 분석 변화를 보여줍니다 체외 억제 분석에을 개발했습니다. 이 작품의 주요 목표는 서로 다른 주제 그룹 간의 비교를 허용 체외 인간 억제 분석에 대해 설명하는 것입니다. 또한이 분석은 기능을 nTreg의 작은 손실을 윤곽을 그리다하고 앞으로 손실, 예방 immunomodulatory 치료 ^1에서 혜택을 누릴 수 있으므로 식별 과목을 예상할 수있는 잠재력이있다. 아래, 우리는이 절차에 관련된 단계 철저한 설명을 제공합니다. 우리는 Treg 기능을 측정하는 데 사용되는 체외 억제 분석에의 표준화에 기여할 수 있도록 최선을 다하겠습니다. 또한, 우리는 면역 불균형의 초기 상태와 T1D에 대한 잠재적인 biomarker 기능을 인식하는 도구로 분석을 제공합니다.

Protocol

1. 억압의 분석을 설정하기 전에, 이후 세포 자극과에 대한 안티 인간 인 경우에는 3 번 CD (복제 UCHT1, 최종 농도 1μg/ml)로 코팅 tosylactivated 구슬 하나 필요는 비즈가 효율적으로 인간을 사용하여 체외 확산 분석에를 설정하여 코팅 여부 확인 T 세포

1. 원래 유리병, 자기 스탠드의 장소에서 M - 450 tosylactivated 구슬의 1ml을 가지고 모든 구슬이 튜브의 측면을 준수 때까지 기다려. 튜브는 자기 서서 아직도있는 동안 버퍼를 제거합니다. 37, 선동을 resuspend 비즈를 buffer1의 1ml 및 안티 인간 인 경우에는 3 번 CD의 40μl를 추가 °, 마그네틱 스탠드 밖으로 튜브를 타고 buffer1의 1ml을 추가, 다시 자기 스탠드에 튜브를 삽입하고 튜브는 자기 스탠드에있는 동안 buffer1를 제거 C 15 분, 0.1 % W / V BSA를 추가하고 다음 16시간에 대한 agitating 계속합니다.
2. 버퍼를 제거하고 buffer2의 1ml에있는 구슬을 resuspend,, 비즈가 ° C 한번 5 분 buffer3에서 2-8에서 ° C 이상의 설명으로 자기 스탠드를 사용하여 2-8에서 5 분 동안 두 번 buffer2에 비즈 와시 4x10 ⁸ /....

Discussion

Tregs 수있는 유일한 고유 기능으로, 진압 기능은 동일한 시간과 여러 연구 사이의 질병 개발의 다른 단계에서 과목 사이에 안정적으로 균일하게 테스트해야합니다. 우리는이 분석의 표준화로 우리의 기여로 저희 연구실에서 개발된 억제 분석의 세부 사항을 제공합니다. 우리의 광범위한 최적화 연구에서는, 우리는 안티 - 인간 인 경우에는 3 번 CD - 코팅 구슬 (APC로 PBMC와 함께 1μg/ml의 농도 UCHT1 복제 (같은 상용 5μg/ml 반대)와 T 세포의 자극 천연 자극을 제공하는 것으로 나타났습니다 단 Ancell 항체가 예상 결과를 준 우리 손에서와 같이 시험 과목 ¹ 잘 응답 T 세포와 Tregs를 모두 활성화 능력. 방지 인간 인 경우에는 3 번 CD에 들어 항체의 선택은 매우 중요합니다. 방지 인간 인 경우에는 3 번 CD 및 안티과 동시 자극이 PBMC는 신호 전달과 효율적인 자극의 기회를 증가, 공동 stimulatory 신호의 전체 팔레트를 제공하면서 인간 CD28는 주제 그룹 (결과가.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약이나 악기의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글 (옵션)
Ficoll - Paque PLUS	애머스햄 Pharmacia 생명 공학	17-1440-03
DPBS - 1X	Gibco	14190-144
Trypan 블루	Invitrogen	15250-061
안티 CD4의 microbeads	Miltenyi	130-045-101
사전 분리 필터	Miltenyi	130-041-407
LS 칼럼	Miltenyi	130-042-401
EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)	Invitrogen	15575-020
BSA	시그마 - 알드리치	B4287
안티 인간 CD4 - APCCy7 (클론 RPA - T4)	BD Pharmingen	557852
안티 인간 CD25 - PE (클론 M - A251, IL - 2Rα)	BD Pharmingen	555432
안티 인간 CD8 - FITC (클론 RPA - T8)	BD Pharmingen	555366
안티 인간 CD14 - FITC (클론 M5E2, LPS 수용체)	BD Pharmingen	555397
안티 인간 CD32 - FITC (클론 FLI8.26, FcγR 타입 II)	BD Pharmingen	555448
안티 인간 CD116 - FITC (클론 M5D12, GM - CSFRα 체인)	BD Pharmingen	554532
Dynalbeads M - 450 tosylactivated	Invitrogen	140-13
안티 - 인간 인 경우에는 3 번 CD에 들어	Ancell	144-024
Buffer1	홈메이드		0.1M 나 2 B 4 O 7 pH7.6
Buffer2	홈메이드		PBS/2mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) / 0.1 % BSA pH7.4
Buffer3	홈메이드		0.2M Tris/0.1 % BSA pH8.5
완료 RPMI 미디어	홈메이드		RPMI 1640 미디어 2 MM L - 글루타민 5 MM의 HEPES 100 U / μg / ML peni / strept 0.5 MM 나트륨 pyruvate
[3 H] thymidine	퍼어킨 엘머	NET027Z005MC
인간의 풀링 AB 혈청	애틀랜타 체액	S40110
Multiscreen 수확 플레이트	Millipore	MAHFC1H60
Microscint 20	퍼어킨 엘머	6,013,6​​21