光学投影トモグラフィを用いたヒト乳癌検体とその分析の長期培養

Summary

我々は、コラーゲンベースを開発している<em> in vitroで</emすべての乳癌のサブタイプのサンプルから増殖と浸潤を促進する>アッセイ。光学投影断層撮影、三次元顕微鏡法は、腫瘍の拡大を視覚化し、定量化するために利用された。このアッセイは、個々の腫瘍サンプルの薬物反応を定量化するために使用されることがあります。

Abstract

乳がんは、西洋世界における死亡の主要な原因です。それはよく乳がんの広がりは、最初にローカルで、後に遠位、患者の予後における主要な因子であることが確立されている。乳癌の実験系は、通常、原発腫瘍または胸水由来の細胞株に依存しています。二つの大きな障害は、この研究の妨げになる：（i）は乳癌のいくつかの既知のサブタイプ（特に予後不良腔側Bの腫瘍は）現在の行のコレクション内で表現されていないこと、（ii）腫瘍の微小環境の影響は、通常は考慮されません。

我々は、すべてのサブタイプの文化原発性乳癌標本のテクニックを示しています。これは、腫瘍の小片が、私はクッションソフトラットのコラーゲンに埋め込まれている3次元（3D）培養系を用いることによって達成される。 2〜3週間以内に、腫瘍細胞はコラーゲンに広がり、人間tumours1で観察されたものと同様の様々な構造を形成する。オリジナルのコア内で実行可能な脂肪細胞、上皮細胞と線維芽細胞は組織学的に明らかにした。 squamoid形態と悪性上皮細胞は、周囲のコラーゲンに侵入する実証された。核多形性は有糸分裂像およびアポトーシス小体とともに、これらの細胞内で明らかであった。

我々は、培養中の腫瘍の広がりの程度を定量化するために光学投影断層撮影法（OPT）、3Dイメージング技術を、採用している。我々は腫瘍の文化のバルク量を測定するためにOPTを使用した、パラメータは、薬物療法に対する反応を評価するために、乳がん患者のネオアジュバント治療中に測定した。

ここでは、サブタイプのバイアスなしで培養ヒト乳癌腫瘍の機会を提示し、それらの生体外での広がりを定量化する。このメソッドは、元の腫瘍の薬剤感受性を定量化するために将来的に使用することができる。これは現在使用されている細胞株よりも多くの予測モデルを提供することがあります。

Protocol

1。ラットの尾からコラーゲンを抽出 70％エタノールで冷凍新鮮なラットの尾を置きます。 メス公開する腱を覆う皮膚をDeglove。 滅菌に離れて70％エタノールで尾と場所から腱を剥ぎ取ります。 収集した腱と酢酸（250ミリリットル0.5M酢酸に1gの腱）への転送を量る。 4℃で48hrのためにミックス℃に 30分間10,000 gで腱/酢酸の混合を遠心し、ペレットを捨てる。 上清に10％の等量（w / v）のNaClを追加し、ミックスは4℃で一晩放置する℃に G. 10,000さらに30分のためのコラーゲンが豊富な、不溶性の底層とcentrifugateを収集する 4℃で0.25M酢酸でコラーゲン豊富な材料° Cを再懸濁し、毎日二度の透析バッファーを変更すること、3日間4℃で1:1000酢酸に対してdialyse。 さらに4℃で遠心分離（2時間、20,000 g）とストアによってコラーゲン溶液を滅菌℃に 1mg/mlのストック濃度に滅菌1:1000酢酸の添加により、必要に応じてコラーゲンを希釈する。 2。 3Dアッセイの作成 3Dアッセイは、以前は次の2発行された、細胞株のアッセイに基づいています。 複数のコア生検は侵襲性乳癌に対する根治的切除術の時に患者の同意から採取されています。 目によって、1ミリメートル3フラグメントにメスを使用してコアを割る。巨視的に異なる脂肪をトリミングして捨てる。 MEGM完全なメディアの断片を浸す。組織は、最大1時間までは、この状態で保存することができます。 氷1mg/mlのラット尾コラーゲンでコラーゲンゲル、ミックスを作成するには、1:1000フィルタリング酢酸、3:5:1:1の比率で10倍DMEM/F12と0.22MのNaOH、0.3の最終コラーゲン濃度を作成するmg / mlの。 37℃インキュベーターに24ウェルプレートおよび場所の個々のウェルにコラーゲンの混合物の1.2ミリリットルを注入℃で10分間ゲル化を開始する。 10分後、インキュベーターから24ウェルプレートを取り外します。ゲル化コラーゲンへの腫瘍片を置き、静かに10μlをピペットチップを用いてゲルの中心にそれらを押してください。 1時間のためのインキュベーターに24ウェルプレートを返します。 ER +腫瘍の場合は、3.2×10 -10 Mの濃度にβ-エストラジオールとMEGM完全なメディアを補完するゲルアッセイは、1時間のためにゲル化した後、慎重に各ウェルに添加培地の1.2ミリリットル紹介します。アッセイ内の最後のβ-エストラジオール濃度は、乳房組織3で見られる生理的なエストロゲンのレベルを再現するために1.6 × 10 -10 Mにequilibriateなります。 各ゲルは、メディア内で自由にフロートすることができますので、円周方向にそれぞれのゲルを放出、各ウェルの内側のエッジの周り10μlをピペットの先端を実行します。インキュベーターに24ウェルプレートを返します。 Exchangeは実験終了まで、メディアは週2回の補足。メディアを削除し、ホルマリン固定液を追加して実験を終了します。 3。光学投影断層撮影の準備のためにアッセイの抗体染色我々は、全サンプルの染色の4の以前に発行された方式を採用している。 PBSで30分のためのホルマリン固定標本を洗浄してください。 33％、66％、各ステップで≥15分のための100％：0.05％ツイーン20（0.05％PBST）を含むPBSで希釈したメタノールで段階的にゲルを脱水する。 DMSO：30％H 2自己蛍光をクエンチするために24時間、室温で2時01分03秒の比率（15％v / vのH 2 O 2）で、O 2、新しく調製MeOH中で組織をインキュベートする。 メタノールで30分間二回のサンプルを洗浄する。 -80 ° C組織の深い部分でその抗原性を確保するために室温（RT）に戻って少なくとも1時間ごとに時間との5倍がレンダリングされるアクセス可能にサンプルを凍結する。 希釈剤（33％、66％、各ステップで15分のための100％）としてメタノールと0.05％PBSTに戻って組織を再水和。 24時間のために溶液（0.05％PBSTで10％血清を）ブロックするに組織をブロックする。 48hr 5％のDMSOを含む溶液をブロッキングの1.5ミリリットルで希釈1:500の濃度でウサギ抗サイトケラチンを使用して、上皮コンテンツを識別するための一次抗体で組織をインキュベートする。 30分ごとに0.05％PBSTで試料を4回洗浄。 48hr 5％のDMSOを含む1.5ミリリットルブロッキング溶液で希釈した蛍光二次抗体（1:100ヤギ抗ウサギAlexa555）で組織をインキュベートする。 30分ごとに、0.05％PBSTで4回、再度サンプルを洗浄してください。 4。光学投影トモグラフィ光学投影断層は最大15ミリメートル5の厚さと蛍光生体試料の高解像度3D画像を生成するために以前に開発された顕微鏡技術です。 sをマウントするtained 1％低融点アガロースのゲルと24時間のために100％メタノールで脱水。 48hrのためバブソリューション（1:2ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル）で試料をクリアして、OPT 3001Mスキャナ（Bioptonics）を使用してスキャン。 ターゲットと自家蛍光の両方をCy3フィルターセット（エキサイター545nm/30 NM、エミッタ75分の610 nm）とそれぞれGFP1フィルターセット（エキサイター425nm/40 NM、エミッタLP475 nm）を使用してキャプチャされます。 5。復興と三次元定量化 OPTが取得した角突起のセットは、浸潤アッセイの断面スライスのシリーズを作成するNReconソフトウェア（SkyScan）を使用して再構成することもできる。このソフトウェアは無償でダウンロードすることが可能ですhttp://www.skyscan.be/products/downloads.htm 。 Volocityソフトウェア（パーキンエルマー社）を使用して再構成されたデータを分析。無料のデモソフトは、でダウンロードすることが可能ですhttp://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/ 。 サイトケラチン染色により上皮量を定量化するために、ターゲットチャネルにおけるバックグラウンド蛍光からの干渉を低減するための最小ボクセル強度のしきい値を設定します。我々は、計測アプリケーションで使用可能なパラメータのリストを使用して9000のauで経験的にこのしきい値を定義した、我々はオリジナルのコア（自家蛍光チャンネルに区分さ）との連続性の上皮の量を定量化した。これは、私たちは異なるとの間で上皮性増殖のボリュームを定量化することを許可腫瘍サンプル。 6。代表的な結果： アッセイの開発中に、52乳癌の合計は、組織病理学の広い範囲で標本を生検に使用されている。これらの<10％の人が（5 / 52）少なくとも一つの実行可能な浸潤アッセイを提供するために失敗した。アッセイの失敗は、上記感染細菌または不十分な腫瘍生検材料によるものであった。したがって、アッセイのアプリケーションは、乳がんの特定のサブタイプに限定されるものではない。 典型的なアッセイ（図1）はコラーゲンの培養で20日後に固定し、その後、サイトケラチンのために染色。 Volocityソフトウェアは、オリジナルのコアと浸潤細胞の分離されたグループとの連続的な上皮バルクの両方を認識し、個別にそれぞれのボリュームを定量化することができます。 固定および定量は、次の図1。浸潤アッセイ。アッセイは、複数の乳癌のサブタイプから得られた試​​料をサポートしています：）ER + b）のHER2 +とc）ER -。

Discussion

癌細胞株の挙動を研究するためにコラーゲンベースのアッセイは、現在広く^6,7,8を使用されています。それにもかかわらず、これらのアッセイは、完全な腫瘍の複雑さとその環境に反映していない。本研究では、我々はヒト乳癌の材料は同じような方法は、ex vivoで使用できることを示す。更に、OPTは、乳がんの3D拡大を特徴付けるために有用なツールです。我々はこの技術の主な制限は、腫瘍の材料（シングルコア生検に4〜6アッセイに十分である）の可用性であることがわかった。別の制限要因は、その構造的な侵略は、アッセイの約40％でのみ発生します。これを克服するために、我々は定期的に目に見える成長とすべてのアッセイに7日目の周りの任意の治療を追加します。

OPTの使用はまた、薬物治療の結果の一括変更、ex vivoで 、検出するために将来的に拡張することができます。これは順番に、動物モデルに依存しない、より個別化がん治療を促進することができます。我々は現在、タモキシフェンex vivoでのER +の腫瘍の反応を探っています。

Materials

Name of Reagent	Company	Catalogue No.
MEGM Complete	Lonza	CC-3150
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D8900 10X1L
β-oestradiol	Sigma-Aldrich	E8875-250MG
Rabbit anti-cytokeratin	Dako	Z0622
Goat anti-rabbit Alexa555	Invitrogen	A21422

All other standard reagents were obtained from Sigma-Aldrich.