البيوفيزيائية فحوصات للتحقيق في الخواص الميكانيكية للنواة الخلية الطور البيني : الركيزة التطبيق الانفعال والتلاعب Microneedle
Summary
نقدم دولتين مستقلتين ، المجهر الأدوات المعتمدة لقياس التشوهات الناجمة عن الأسلحة النووية وهيكل الخلية في الخلايا واحد ، ملتصقة يعيشون في استجابة لطلب سلالة عالمية أو محلية. وتستخدم هذه التقنيات لتحديد صلابة النووية (أي قابلية تغيير الشكل) وبين الخلايا لبحث انتقال القوة بين النواة والهيكل الخلوي لل.
Abstract
في معظم الخلايا حقيقية النواة ، النواة هي أكبر عضية وعادة 2 إلى 10 مرات أكثر صلابة الهيكل الخلوي المحيطة ، وبالتالي ، فإن الخصائص الفيزيائية للنواة تسهم إسهاما كبيرا في سلوك النشاط الحيوي لخلايا الكلية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. على سبيل المثال ، في هجرة العدلات وغزو خلايا السرطان ، وتصلب النووية يمكن أن تشكل عقبة رئيسية خلال تسرب أو المرور عبر المساحات الضيقة داخل الأنسجة. 1 ومن ناحية أخرى ، فإن نواة الخلايا في الأنسجة النشطة مثل العضلات ميكانيكيا يتطلب دعما كافيا لالهيكلية تحمل الضغوط الميكانيكية المتكررة. الأهم ، هو نواة تتكامل في العمارة الخلوية ؛ يرتبط فعليا إلى الهيكل الخلوي المحيطة بها ، وهو شرط حاسم لحركة الخلايا وتحديد المواقع للنواة ، على سبيل المثال ، في خلايا الاستقطاب ، نوى متشابك عند التقاطعات العصبية والعضلية ، أو في الخلايا المهاجرة. 2 وليس من المستغرب ، وقد تبين أن الطفرات في البروتينات المغلف النووية مثل lamins nesprins والتي تلعب دورا حاسما في تحديد صلابة النووية واقتران نكليوتيد ، هيكل الخلية ، في الآونة الأخيرة إلى نتيجة في عدد من الأمراض التي تصيب الإنسان ، بما في ذلك الحجر ، دريفوس ضمور العضلات ، الأطراف الاصطناعية الزنار ضمور العضلات وتمدد عضلة القلب. 3 لتحقيق وظيفة من مختلف البروتينات البيوفيزيائية المغلف النووية وتأثير الطفرات محددة ، قمنا بتطوير الطرق التجريبية لدراسة الخصائص الفيزيائية للنواة في الخلايا ، واحدة تعيش تعرض لاضطراب الميكانيكية عالمية أو محلية. قياس التشوهات الناجمة النووية ردا على تطبيقها بدقة الركيزة تطبيق سلالة يعطي معلومات هامة عن قابلية تغيير الشكل من نواة ، ويسمح بالمقارنة بين كمية طفرات مختلفة أو ناقصة عن خطوط الخلايا المحددة البروتينات المغلف النووية. يستخدم التطبيق المترجمة سلالة هيكل الخلية مع microneedle لتكملة هذا الاختبار ، ويمكن أن تعطي معلومات إضافية بشأن انتقال قوة الخلايا بين النواة والهيكل الخلوي لل. دراسة الميكانيكا النووي في الخلايا الحية سليمة تحافظ على بنية الخلايا العادية والابتعاد عن القطع الأثرية المحتملة التي يمكن أن تنشأ عند العمل مع نواة معزولة. علاوة على ذلك ، الركيزة تطبيق سلالة يقدم نموذجا جيدا للإجهاد الفسيولوجية التي تعيشها الخلايا في العضلات أو الأنسجة الأخرى (، وعائي مثل خلايا العضلات الملساء المعرضة للإجهاد السفينة). أخيرا ، في حين وضعت هذه الأدوات بشكل أساسي لدراسة الميكانيكا النووية ، ويمكن أيضا أن تطبق على التحقيق وظيفة من البروتينات ويشير هيكل الخلية mechanotransduction.
Protocol
Discussion
الركيزة سلالة مقايسة
وقد تم تطبيق سلالة استخدمت بنجاح من قبلنا وجماعات أخرى لدراسة التشوهات الناجمة النووي في الخلايا تتعرض لإجهاد ميكانيكي والتحقيق مساهمة محددة البروتينات المغلف النووية لتصلب النووية. 4-8 الاستفادة من هذ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01 R01 HL082792 وNS059348) وبريغهام ومستشفى النساء في مجموعة القيادة جائزة القلب والأوعية الدموية.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number |
| Fibronectin | Millipore | FC010 |
| MitoTracker Red FM and Green FM | Invitrogen | M22425 and M-7514 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 |
| Hank’s Buffered Salt Saline | Invitrogen | 14185 |
| Phenol free, DMEM | Invitrogen | 21063 |
| Fetal bovine serum | Aleken Biologicals | FBSS500 |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P0781-100ML |
| Borosilicate Glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 |
| Gloss/Gloss non-reinforced silicone sheeting, 0.005″ | Specialty Manufacturing Inc. | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14200 |
| 35 mm glass bottom culture dishes (FluoroDish) | World Precision Instruments, INC | FD35-100 |
| Braycote 804 Vacuum Grease | Spi supplies | 05133A-AB |
References
- Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. Nuclear mechanics during cell migration. Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).
- Mejat, A., Misteli, T. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1, 40-52 (2010).
- Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G. Laminopathies and the long strange trip from basic cell biology to therapy. J Clin Invest. 119, 1825-1836 (2009).
- Caille, N., Tardy, Y., Meister, J. J. Assessment of strain field in endothelial cells subjected to uniaxial deformation of their substrate. Ann Biomed Eng. 26, 409-416 (1998).
- Lammerding, J. Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics. J Biol Chem. 281, 25768-25780 (2006).
- Lammerding, J. Abnormal nuclear shape and impaired mechanotransduction in emerin-deficient cells. J Cell Biol. 170, 781-791 (2005).
- Lammerding, J. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).
- Verstraeten, V. L., Ji, J. Y., Cummings, K. S., Lee, R. T., Lammerding, J. Increased mechanosensitivity and nuclear stiffness in Hutchinson-Gilford progeria cells: effects of farnesyltransferase inhibitors. Aging Cell. 7, 383-393 (2008).
- Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice. J Physiol. 488, 459-469 (1995).
- Maniotis, A. J., Chen, C. S., Ingber, D. E. Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure. Proc Natl Acad Sci. 94, 849-854 (1997).
