एक 3 – आयामी मैट्रिक्स कोलेजन प्रकार मैं और प्राथमिक मानव fibroblasts से मिलकर की तैयारी के लिए एक विधि वर्णित है. इस organotypic जेल इनवेसिव सेल प्रवास का आकलन करने के लिए एक उपयोगी सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है क्योंकि यह mimics ऊतक stroma की बुनियादी सुविधाओं और माइक्रोस्कोपी के कई रूपों के लिए उत्तरदायी है.
सेल प्रवास जीव विज्ञान के विकास, घाव भरने, प्रतिरक्षा प्रणाली के सेलुलर प्रतिक्रियाओं, और ट्यूमर कोशिकाओं के मेटास्टेसिस सहित कई पहलुओं के लिए मौलिक है. प्रवासन कांच coverslips पर अध्ययन किया गया है क्रम में प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा सेलुलर गतिशीलता की जांच करने के लिए उत्तरदायी बनाने के लिए. हालांकि, यह स्पष्ट हो गया है कि सेल प्रवास के कई पहलुओं को स्थानीय पर्यावरण की अपनी लोच, प्रोटीन संरचना, और ध्यान में लीन होना आकार है, जो ईमानदारी से कठोर कांच और प्लास्टिक 1 के रूप में इस तरह के दो आयामी substrates द्वारा प्रतिनिधित्व नहीं कर रहे सहित सुविधाओं पर निर्भर है. इसके अलावा, stromal 2 fibroblasts और प्रतिरक्षा 3 कोशिकाओं सहित अन्य प्रकार की कोशिकाओं, के साथ बातचीत के कैंसर की कोशिकाओं के आक्रमण को बढ़ावा देने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा दिखाया गया है. आणविक स्तर पर जांच तेजी से पता चला है कि दवा उपचार के लिए समान कोशिकाओं की प्रतिक्रिया, सहित आणविक गतिशीलता, काफी अलग हैं जब तुलना <em> इन विट्रो में और vivo में 4.
आदर्श रूप में, यह सबसे अच्छा होना अपने रहने वाले जीवों में स्वाभाविक रूप से होने वाली संदर्भ में सेल प्रवास का अध्ययन करेगा, लेकिन यह हमेशा संभव नहीं है. सेल व्युत्पन्न मैट्रिक्स, Matrigel, organotypic संस्कृति (यहाँ वर्णित) ऊतक explants, organoids, और xenografts के रूप में मध्यवर्ती टिशू कल्चर प्रणाली, इसलिए कर रहे हैं महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक मध्यवर्ती. Vivo वातावरण में एक के इन प्रणालियों के लगभग कुछ पहलुओं पर अधिक stably ट्रांसफ़ेक्ट सेल लाइनों, नशीली दवाओं के उपचार के शासनों, दीर्घकालिक और उच्च संकल्प इमेजिंग के उपयोग जैसे प्रयोगात्मक हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी हैं. ऐसे मध्यवर्ती सिस्टम साबित जांच मान्य है और vivo में इमेजिंग 5 उपक्रम पहले कोशिकाओं और फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से गतिशील प्रतिक्रिया की छवि के लिए आवश्यक मानकों की स्थापना के लिए आधार के रूप में विशेष रूप से उपयोगी हैं. जैसे, वे जीने पर प्रयोगों के लिए की जरूरत को कम करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका की सेवा कर सकते हैंछ जानवरों.
यहाँ हम एक 3 आयामी इनवेसिव सेल 6-8 प्रवास के अध्ययन के लिए उपयुक्त मैट्रिक्स के उत्पादन के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. मैट्रिक्स कोलेजन टाइप 1 तंतुओं, जो कई दिनों की अवधि में प्राथमिक मानव epidermal fibroblasts द्वारा अनुबंधित कर रहे हैं के होते हैं. कोलेजन एसिड निष्कर्षण, नहीं है, जो पाली पेप्टाइड सिरों पर जेट को बरकरार रखता है और कोलेजन तंतुओं के बफर 9 शर्तों के निराकरण पर बड़ा समुच्चय में पार से जोड़ने को बढ़ावा देता है enzymatic पाचन द्वारा तैयार किया जाता है. फिर से गठित की है जो और अधिक बारीकी से vivo में कोलेजन की सुविधाओं mimics और जैल में संवर्धित कोशिकाओं के आक्रामक गुणों के लिए महत्वपूर्ण परिणाम है एक जेल में यह परिणाम है. यह बात है कि ताजा या फ्रोजन शुरू सामग्री का इस्तेमाल किया जाता है नहीं है, करता है, लेकिन किशोर चूहे की पूंछ का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि कोलेजन पार से जोड़ने छोटे जानवरों में अधिक अस्थिर है. कोलेजन मैं छोटे जानवरों से इसलिए आसान है निकालने के, और w फिर से गठन कियाith उच्च निष्ठा.
मैट्रिक्स कोलेजन और तय किया जा सकता है या तो आक्रामक ट्यूमर कोशिकाओं या stromal fibroblasts 2,10 के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ दाग और दवाओं जो 5,6 आक्रमण बाधित हो सकता है की प्रभावकारिता के परीक्षण के लिए बहुत उपयोगी हैं.
हालांकि इस प्रोटोकॉल प्राथमिक मानव त्वचा fibroblasts के उपयोग से पता चलता है, यह जांच के तहत ऊतक के प्रकार के अनुसार, अन्य प्रकार के ऊतक से प्राथमिक fibroblasts का उपयोग संभव है. यह भी संभव है कोशिकाओं जो stably किया गया है फ्लोरोसेंट प्रोटीन conjugates साथ ट्रांसफ़ेक्ट सहित अमर fibroblasts, का उपयोग संस्कृतियों स्थापित. इस तरह दोनों stromal और ट्यूमर कोशिकाओं 11 आक्रमण के दौरान सेल सेल बातचीत कल्पना करने के लिए नामांकित किया जा सकता है.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
10x MEM | Gibco | 21430 | – |
NaOH | Sigma | 367176-500G | Prepare 0.22 M stock in water |
FCS | PAA Laboratories | A15-101 | – |
35 mm dishes | Falcon | 353001 | For step 3.4 |
60 mm dishes | Falcon | 353004 | For step 5.2 |
Spring forceps blunt | Samco | E003/02 | Toothed, not smooth |
16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | Dilute to 4% in PBS prior to use |
Screens for cd-1, size 40 mesh | Sigma | S07707-5EA | Stainless steel grids, 5 per pack |
Dialysis tubing | Medicell International | 7607 2295 | 12 – 14 kD |
PBS | Oxoid | BR0014G | – |
Acetic Acid | Sigma | 242853 | – |
24 well dish | Falcon | 353047 | For step 4.1 |
Fungizone | In vitrogen | 15290018 | – |