Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis complex para drogas de primera línea y la segunda por dilución en caldo en un formato de placa de microtitulación

Summary

Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis es difícil, pero fundamental para el cuidado del paciente. Este formato de placa de microtitulación ofrece la prueba de 12 medicamentos antimicobacterianos y proporciona la concentración inhibitoria mínima (CIM) los valores, que ayudará en el tratamiento adecuado.

Abstract

La rápida detección de resistencia a los antimicrobianos es importante en el esfuerzo por controlar el aumento de la resistencia de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana (AST) de Mtb tradicionalmente ha sido realizado por el método de la proporción de agar o las pruebas macrobroth en un instrumento como el BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (Diagnóstico TREK, Cleveland, OH) o BacT / ALERT (bioMérieux, Hazelwood, MO). El método de proporción de agar, mientras que considera el "gold" estándar de AST, es un trabajo intensivo y requiere el cálculo de la resistencia mediante la realización de recuentos de colonias en agar que contiene el fármaco en comparación con el agar libre de drogas. Si hay crecimiento de ≥ 1% en el medio que contiene el fármaco en comparación con la droga libre de soporte, el microorganismo se considera resistente a ese medicamento. Los métodos macrobroth requieren instrumentación y el punto de prueba de ruptura ("crítica"), las concentraciones de drogas para los medicamentos de primera línea (isoniazida, etambutol, rifampicina y pirazinamida). El método descrito aquí está comercialmente disponible en un formato de 96 pocillos de microtitulación [MYCOTB (Diagnóstico TREK)] y contiene concentraciones crecientes de 12 de los antimicrobianos utilizados para el tratamiento de la tuberculosis entre los dos primeros (isoniacida, rifampicina, etambutol) y medicamentos de segunda línea (amikacina, cicloserina, etionamida, kanamicina, moxifloxacina, ofloxacino, ácido para-aminosalicílico, la rifabutina y estreptomicina). Pirazinamida, un fármaco de primera línea, no está incluido en la placa de microtitulación, debido a su necesidad de condiciones de la prueba ácida. Ventajas del sistema de microtitulación incluyen tanto la facilidad de instalar y más rápido tiempo de vuelta (14 días) en comparación con la proporción de agar tradicional (21 días). Además, la placa se puede configurar de inóculo preparado utilizando caldo o medio sólido. Dado que el formato de placa de microtitulación es nuevo y ya Mtb presenta retos únicos de seguridad en el laboratorio, este protocolo se describe cómo configurar de forma segura, incubar y leer la placa de microtitulación.

Protocol

Cada laboratorio debe realizar una evaluación de riesgos en colaboración con su Oficial Institucional de Seguridad Biológica para determinar el nivel apropiado de bioseguridad para la preparación del inóculo y para pipetear del inóculo en la placa. En nuestro laboratorio, utilizamos el nivel 3 de bioseguridad de laboratorio (BSL3) las prácticas hasta que las placas de microtitulación se inoculan, y sellado con un sello adhesivo plástico. Estas placas se colocan dentro de una bolsa de plástico, que es el calor también está sellado. Lectura e interpretación de incubación de la placa de microtitulación se lleva a cabo en un laboratorio de bioseguridad nivel 2 (BSL2). 1. Etiquetado de los materiales Etiqueta de una placa de agar sangre, tres placas de Middlebrook 7H10, caldo de Middlebrook 7H9, una solución salina entre tubo de vidrio de cuentas y una placa de microtitulación AST con los identificadores adecuados (por ejemplo, el nombre del paciente, número de historia clínica) en el BSL2. Etiqueta de la sangre y agar 7H10 plateado como "comprobar la pureza". Recuentos periódicos colonia del inóculo se recomienda asegurarse de que una concentración adecuada de los organismos se utiliza en la prueba. El recuento de colonias cuando se realiza tendrá que contar con dos de las placas de 7H10 etiquetados con "count 01.01 colonia" y del "número 1 / 50 colonias". 2. Preparación técnico para ir a la BSL3 El equipo de protección personal es necesario trabajar en la BSL3 e incluye sólido frente vestido, cubierta de la cabeza, guantes, cubiertas para los zapatos, y un respirador. Cada institución debe establecer su propio plan de protección respiratoria, en colaboración con el oficial de su institución de Higiene Industrial. En nuestro laboratorio, tenemos varios respiradores disponibles, incluida la alimentación respiradores purificadores de aire (PAPR) y equipado con filtro HEPA, los respiradores N95 mitad de la cara. 3. Preparación de la cabina de seguridad biológica En el BSL3, preparar la cabina de seguridad biológica (BSC) por la desinfección de la superficie y colocando una toalla de papel empapada con desinfectante de aproximadamente 6 pulgadas desde el panel de ventilación de aire. Coloque un contenedor de residuos de la izquierda, y nephlometer pequeñas y vórtice de la derecha. Bucles de inoculación, pipetors y consejos se colocan al lado de la toalla de papel. Coloque una parrilla con el organismo (en caldo o en medio sólido) y el 0,5 McFarland estándar en la toalla de papel. 4. La calibración del nefelómetro Coloque un tubo de solución salina entre cuentas de vidrio en el nefelómetro y poner el instrumento a cero con la solución salina en blanco entre. Coloque el estándar de 0,5 McFarland en el nefelómetro y calibrar según las instrucciones del fabricante. 5. Preparación del inóculo De trabajo en las colonias raspar BSC, de medio sólido con un asa estéril en el tubo debidamente etiquetado salinas entre cuentas de vidrio hasta un ≥ 0,5 McFarland estándar se obtiene. Inspeccione visualmente la muestra, y comparar con el estándar de McFarland. Vórtice de la muestra durante 30-60 segundos. Deje que el inóculo que conformarse con 15 minutos (un cronómetro). 6. La inoculación de la placa de microtitulación Ajuste del inóculo con solución salina caldo entre usar el nefelómetro calibrado a la McFarland 0,5 en pasos de 4.1 y 4.2. Esto se debe completar en 30 minutos (según las especificaciones del fabricante). Utilice una pipeta de 200 ly una punta de aerosol LARGO pipeta resistentes a eliminar 100 L de inóculo a partir de la tercera TOP 1 / 3 de la solución salina tubo de cuentas entre. Inocular el caldo Middlebrook 7H9. Poco a poco el caldo inoculado vórtice 7H9 durante 20 segundos. Retire la placa de microtitulación AST del paquete del fabricante. No lo use si el desecante es de color azul o si el paquete de aluminio está dañado. Preparar un tubo de dilución de 1:50 para su posterior uso en la preparación de la dilución 1:50 con la pipeta 50 l de agua estéril en un tubo estéril. Con cuidado, vierta el caldo 7H9 inóculo en un canal. Evitar generar aerosoles. Coloque la placa de microtitulación de AST con la etiqueta hacia usted. Utilice una pipeta de 12 canales para añadir 100 ml de inóculo a cada pocillo. Preparar las diluciones para el recuento de colonias: La dilución de 1 / 1 se prepara a partir del control positivo y (H12) por rayar un bucle l en la placa de 7H10 con la etiqueta "1.1". La dilución 1 / 50 se prepara mediante la inoculación de un circuito de 1 l de control positivo y (H12) y girando en el tubo con 50 l de tubo de agua preparada anteriormente. Una racha de L de esta dilución a la placa "1 / 50". Inocular las placas de la pureza de la cubeta con la pipeta 50 L en un agar sangre debidamente etiquetados y la placa de 7H10 y raya para el aislamiento. Lugarun sello adhesivo en la placa de microtitulación de AST. Presione con firmeza en cada pozo para asegurar estanqueidad adecuada mediante el uso de la parte posterior del blanco de la junta. Evitar las arrugas. La desinfección de la placa de microtitulación frotándolo con una toalla de papel empapado con un desinfectante tuberculocida y placa de microtitulación en una bolsa de plástico y cierre con un sello de calor o de la cinta. La bolsa de plástico sirve como un contenedor secundario para asegurarse de que todos los caldos se encuentra debe haber una fuga o derrame de la placa principal. 7. Desinfección de materiales y el gabinete de seguridad biológica Para evitar la producción de aerosoles, en otro lugar a través en la parte superior del canal inoculadas antes de colocarlo suavemente en el recipiente de descarte. Desinfectar todos los materiales incluyendo nephlometer, vórtice, placas, tubos, etc al lavarlo con un desinfectante tuberculocida y esperar el momento adecuado para asegurar la desinfección de acuerdo a las instrucciones del fabricante antes de sacarlo del BSC. Por ejemplo, ProSpray, el desinfectante tuberculocida usamos, requiere 15 minutos para matar las micobacterias. Coloque el recipiente de descarte en una bolsa de riesgo biológico y sellado antes de esterilizar. 8. Incubación Las placas deben ser incubadas con los medios de comunicación hacia abajo y se debe tener cuidado para evitar derrames o salpicaduras de cualquier líquido. Incubar la placa de microtitulación AST placa, 7H10 y las placas de agar sangre en una incubadora de 35 a 37 ° C con 5-10% CO 2 con 5-10% CO 2 en el laboratorio BSL2. En nuestro laboratorio, esto es aceptable, ya que la placa esté bien sellada y dentro de una bolsa de plástico sellada. No más de 2 placas de microtitulación AST se deben apilar en la incubadora de acuerdo a las instrucciones del fabricante. 9. Los resultados representativos Interpretación de los resultados: Sellado AST placas de microtitulación se pueden leer de forma manual usando un espejo como una ayuda o con un lector de placas automatizado como el Vizion (Diagnóstico TREK). Las placas pueden ser examinadas en cuanto a los 7 días después de la inoculación. Examinar los pozos de control de crecimiento en puestos de H11 y H12 para determinar si son positivos (es decir, tener un depósito de células en el fondo del pozo). Si los pozos de control de crecimiento no son positivas, reincubate la placa y volver a examinar de forma periódica (por ejemplo, el día 10, día 14) hasta los pozos de control de crecimiento son positivas. Espejo decía: Lugar cerrado AST placa de microtitulación en la plataforma; Lea los pozos de control de crecimiento después de 7 días de incubación, cuando éste sea negativo, reincubate AST placa de microtitulación; Si los controles de crecimiento son aceptables, a continuación, lea los pozos que contiene droga. Para cada medicamento, registrar la primera dilución que no tiene el crecimiento mediante la comparación de los pozos de drogas con el control del crecimiento. El crecimiento se presenta como la turbidez o como un depósito de células en el fondo de un pozo. Instrumento de lectura: seguir las instrucciones del fabricante, las instrucciones a continuación son un ejemplo de cómo la lectura se hace con la plataforma Vizion: Log in Use "MYCOTB" software placa de AST. Coloque la placa de sellado con el código de barras frente al usuario. El crecimiento se presenta como la turbidez o como un depósito de células en el fondo de un pozo. Lea controla el crecimiento, cuando éste sea negativo, reincubate AST placa de microtitulación, si es positivo leer la placa tocando la pantalla con el primer pozo de cada medicamento que no muestra crecimiento. Leer las placas pureza. La placa de agar sangre no debe mostrar un crecimiento después de 48 horas y la placa de pureza 7H10 debe tener un crecimiento confluente del tipo de organismo una. Si está contaminado, la prueba de microtitulación AST debe repetirse a partir de un cultivo puro. Calcular el recuento de colonias del control positivo y utilizando la tabla siguiente: Key Colony Conde # Colonias contadas en la placa de la etiqueta "1.1" # Colonias contadas en la placa "1 / 50" Inóculo recuento de colonias (ufc / ml) <50 0 <5 X 10 4 50-100 0-2 5 x 10 4 a 1 X 10 5 > 100 ≤ 10 1 X 10 5 al 05 X 10 5 > 100 > 10 > 5 X 10 5 No puede ser posterior con ácido para-aminosalicílico en algunas cepas de Mycobacterium tuberculosissis. Esto puede ser interpretado por mirar a todos los pozos que tienen y el uso de pellets en el primer pozo que tiene el mismo tamaño de las pastillas como la dilución siguiente como el punto final. La resistencia es rara, con este medicamento. Figura 1. Los resultados representativos con la placa MYCOTB. Abreviatura de drogas Droga MIC μ / ml OFL ofloxacina 16 MXF moxifloxacino 8 RIF rifampicina > 16 AMI amikacina 0.5 STR estreptomicina 16 RFB rifabutina 8 PAS p-aminosalicílico ≤ 0,5 ETH etionamida 5 CYC cicloserina 4 INH isoniazida 2 KAN kanamicina 1.2 EMB etambutol 4.0

Discussion

Un ejemplo de una placa de microtitulación AST que tiene controles de crecimiento positivo se muestra en la Figura 1 y el MIC final (g / ml) para cada droga es un círculo. Un estudio realizado en nuestro laboratorio indican que el método de la placa de microtitulación de AST es equivalente a la proporción de oro método estándar de agar para determinar la susceptibilidad de Mycobacterium tuberculosis. Más rápida presentación de los resultados se obtuvo con microtiter AST placa de microtitulación en comparación con el método de agar proporción tradicional con la interpretación final de AST microplaca y el método de proporción de agar a 14 y 21 días, respectivamente.El AST microplaca tiene la ventaja de la primera prueba y medicamentos de segunda línea al mismo tiempo que puede ayudar a prevenir demoras excesivas con cepas resistentes. La placa de microtitulación de AST es mucho más fácil de configurar y leer que la APM y los dos un espejo manual y un sistema semi-automático, como el Vizion se puede utilizar para leer las placas. La disponibilidad de un valor de MIC para probar la resistencia a los medicamentos antituberculosos pueden proporcionar información nueva y valiosa a los médicos en relación con el valor de la concentración crítica tradicional, especialmente para aquellos aislados con "límite" la susceptibilidad.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
AST microtiter plates and adhesive seal	TREK Diagnostics, Cleveland Ohio	MYCOTB
McFarland 0.5 standard	TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio	E1041
Middlebrook 7H10 plates	Fisher
Blood Agar Plates	Fisher
Sterile loops 1 μL	Fisher
Sterile loops 10 μL	Fisher
Sensititre Saline-Tween glass bead broth	TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio	27143
7H9 OADC Broth	TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio	T3440
Long Pipet Tips	Fisher
Sterile Troughs	TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio
M. tuberculosis	ATCC	27294
Pipeters: 1000, 200, 20μL	Fisher
Tips 1000, 20, 20 μL	Fisher
Multichannel Pipetter	Fisher
Incubator 5-10% CO2	Fisher
Plastic bags, small, CO2 permeable	Poly Plastic, Delano, PA
TB disinfectant (Such as ProSpray C-60)	Certol International, Commerce City, CO	PSC60/32
Mirror Box Reader	Fisher