कपालीय रेडियोथेरेपी की वजह से संज्ञानात्मक रोग की बहाली के लिए स्टेम सेल प्रत्यारोपण रणनीतियाँ

Summary

ब्रेन ट्यूमर के रोगियों को नियमित रूप से कपाल रेडियोथेरेपी से गुजरना है, और फायदेमंद है, इस इलाज दुर्बल संज्ञानात्मक रोग में अक्सर परिणाम जबकि. वर्तमान में यह गंभीर अनसुलझे समस्या है, कोई नैदानिक ​​सहारा, और हमारे प्रयासों विकिरण प्रेरित संज्ञानात्मक decrements की वसूली के लिए स्टेम सेल आधारित चिकित्सा वसीयत संचालित.

Abstract

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation can induce a progressive and debilitating decline in cognition that may, in part, be caused by the depletion of neural stem cells. Given the increased survival of patients diagnosed with brain cancer, quality of life in terms of cognitive health has become an increasing concern, especially in the absence of any satisfactory long-term treatments.

To address this serious health concern we have used stem cell replacement as a strategy to combat radiation-induced cognitive decline. Our model utilizes athymic nude rats subjected to cranial irradiation. The ionizing radiation is delivered as either whole brain or as a highly focused beam to the hippocampus via linear accelerator (LINAC) based stereotaxic radiosurgery. Two days following irradiation, human neural stem cells (hNSCs) were stereotaxically transplanted into the hippocampus. Rats were then assessed for changes in cognition, grafted cell survival and for the expression of differentiation-specific markers 1 and 4-months after irradiation. Our cognitive testing paradigms have demonstrated that animals engrafted with hNSCs exhibit significant improvements in cognitive function. Unbiased stereology reveals significant survival (10-40%) of the engrafted cells at 1 and 4-months after transplantation, dependent on the amount and type of cells grafted. Engrafted cells migrate extensively, differentiate along glial and neuronal lineages, and express a range of immature and mature phenotypic markers.

Our data demonstrate direct cognitive benefits derived from engrafted human stem cells, suggesting that this procedure may one day afford a promising strategy for the long-term functional restoration of cognition in individuals subjected to cranial radiotherapy. To promote the dissemination of the critical procedures necessary to replicate and extend our studies, we have provided written and visual documentation of several key steps in our experimental plan, with an emphasis on stereotaxic radiosurgey and transplantation.

Protocol

हमारे प्रयोगात्मक योजना रेखाचित्र के रूप में चित्र 1 में diagrammed है. 1. विकास और प्रत्यारोपण के लिए मानव तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) की तैयारी EnStem एक सेल लाइन (ईएमडी Millipore) इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था. एनएससी नियमित multipotent मार्करों nestin और Sox2 की अभिव्यक्ति के उच्च स्तर है, और कई neuronal phenotypes में अंतर के बाद एक सामान्य कुपोषण बनाए रखने की क्षमता के साथ साथ pluripotent अक्तूबर 4 मार्कर, कम स्तर की अभिव्यक्ति के लिए निर्माता की पुष्टि करते हैं कई मार्ग है. हमारे विकास शर्तों के तहत, इन एनएससी Sox2 और nestin के प्रचुर मात्रा में अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया और उनके लिए अंतर करने की क्षमता को बनाए रखा, के रूप में 1 पहले से वर्णित है. एनएससी (20 μg / मिलीलीटर) पाली एल-ओर्निथिन और laminin (5 μg / मिलीलीटर) लेपित टिशू कल्चर इलाज बोतल पर बड़े हो रहे थे. कक्ष तंत्रिका विस्तार मध्यम (Millipore) एल glutamine (2 मिमी) के साथ पूरक और बुनियादी fibroblast में बड़े हो रहे थेवृद्धि कारक (bFGF, 20 एनजी / मिली). एनएससी के अनुयायी monolayers हर दूसरे दिन (1:2) हदबंदी एजेंट के रूप में 1 accutase साथ passaged थे. प्रत्यारोपण के अध्ययन के लिए, एनएससी मार्ग पर 10 से नीचे में इस्तेमाल किया गया. एनएससी 5 – ब्रोमो 2'- deoxyuridine (BrdU) के साथ तीन दिन पहले प्रत्यारोपण के लिए 4 सुक्ष्ममापी BrdU के साथ विकास मीडिया का सप्लीमेंट द्वारा लेबल थे. सत्यापित BrdU लेबलिंग सूचकांक (यानी BrdU सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत), कोशिकाओं कक्ष स्लाइड्स पर चढ़ाया गया और BrdU मानक immunocytochemical दृष्टिकोण का उपयोग कर पता लगाने के लिए कार्रवाई की . प्रत्यारोपण के लिए उपयोग कक्ष नियमित 90 2% से अधिक में सूचकांक लेबल दिखा रहे हैं. वैकल्पिक रूप से, प्रतिरोपित मानव स्टेम कोशिकाओं मानव विशिष्ट परमाणु प्रतिजन (HuNu) मार्कर 2 का उपयोग करते हुए पाया गया. प्रत्यारोपण के दिन, accutase और तंत्रिका विस्तार मीडिया को एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पूर्व गरम. कक्ष ऊष्मायन मध्यम में रखा गया (तंत्रिका विस्तार 10 सुक्ष्ममापी युक्त मीडियावाई +२७,६३२ के एक घंटे के लिए). वाई +२७,६३२ (रॉक अवरोध करनेवाला, ईएमडी – Calbiochem) एनएससी के बाद प्रत्यारोपण के अस्तित्व में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. एक घंटे के बाद, ऊष्मायन मीडिया हटा दिया है और 5 मिनट के लिए कोशिकाओं accutase के साथ इलाज किया गया. इस संक्षिप्त उपचार के बाद न्यूरल विस्तार मीडिया के एक बराबर मात्रा जोड़ने के लिए accutase बेअसर और एक 70 सुक्ष्ममापी सेल झरनी के माध्यम से कोशिकाओं को तनाव. रुधिरकोशिकामापी के साथ कक्षों की गणना और 1.0 x 10 5 microliter प्रति इंजेक्शन के माध्यम से जीना एनएससी (तंत्रिका विस्तार मीडिया वाई – 27,632, 40 एनजी / एमएल bFGF, 20 एनजी / एमएल BDNF के 10 सुक्ष्ममापी युक्त) तैयार है. तंत्रिका कक्ष विस्तार मीडिया में संग्रहीत किया गया (के रूप में 1.5 में वर्णित) और प्रत्यारोपण के समय तक बर्फ पर रखा, और 6 के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए करने के लिए लंबे समय तक ठंड भंडारण के द्वारा कोशिका मृत्यु को कम करने. 2. रेडियोथेरेपी उपचार योजना और विकिरण बेहोश athymic नग्न चूहा (ओं) को एक प्रयोगशाला एमआरआई स्कैनर में प्रवण पदों में रखा गया n बेहतर अंत में खोपड़ी के साथ (पहले सिर). यह 3 tesla स्कैनर छोटे जानवर स्कैन के लिए डिज़ाइन किया गया है. यह उच्च स्थानिक संकल्प पार के अनुभागीय छवियों (axial) के साथ उत्तम नरम ऊतक विपरीत प्रदान कर सकते हैं. खोपड़ी और 0.8 मिमी छवि मोटाई के साथ 22 टी 2 E60 के भारित छवियों का एक सेट के क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित स्कैन उत्पन्न थे. इन छवियों के चूहा मस्तिष्क के भीतर बाएँ और दाएँ hippocampi पहचान के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करते हैं. एमआरआई स्कैन (24 घंटों का), जानवरों को बेहोश थे [संज्ञाहरण कॉकटेल (ketamine, 30 मिलीग्राम / किलो, xylazine, 2.5 मिलीग्राम / किलो और acepromazine, 1 मिलीग्राम / किग्रा)] के बाद और एक विकिरण ऑन्कोलॉजी सीटी स्कैनर जहां एक पार के अनुभागीय में रखा (axial) छवि मात्रा उत्पन्न किया गया. चूहे में रखा गया था समान या एक ही स्थिति के रूप में एमआरआई स्कैन के लिए इस्तेमाल किया और सीटी इकाई खोपड़ी क्षेत्र स्कैन करने के लिए स्थापित किया गया था करने के लिए करीब है. 0.8 मिमी छवि मोटाई के साथ 106 सीटी छवियों के एक अध्ययन में उत्पन्न किया गया है जो सीटी उपचार योजना बना डेटा बन गया. उपचार योजना"हा> एमआरआई और सीटी छवि डेटा DICOM (डिजिटल इमेजिंग और चिकित्सा में संचार) के माध्यम से उपचार ECLIPSE (Varian मेडिकल सिस्टम्स, Palo Alto, CA) की योजना बना सॉफ्टवेयर के लिए हस्तांतरित किया गया. ECLIPSE एक परिष्कृत और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विकिरण ऑन्कोलॉजी में इस्तेमाल करने के लिए मॉडल और एक रोगी के लिए सबसे अच्छा विकिरण उपचार योजना डिजाइन सॉफ्टवेयर है. यह अंग घनत्व जानकारी है कि सीटी छवि डेटा से निकाला जाता है और शरीर के भीतर विकिरण खुराक के वितरण की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता शामिल हैं. कवर जानवर का उपयोग केवल सिर के साथ एक छोटी सी शल्य टांगना उजागर. Stereotaxic फ्रेम (बेंचमार्क डिजिटल, Leica myNeurolab) के भीतर दृढ़ता से बाहरी कर्णद्वार में कान सलाखों के डालने से पशु सिर की स्थिति. अत्यधिक ध्यान रखना जब कान नहर में कान पट्टी की नोक फिसलने. छेनी बार चूहे के ऊपरी incisors hooking और मानक संदर्भ बिंदु के लिए पट्टी ऊंचाई का समायोजन करके रखें, तो नाक क्लंप कस लें. स्थिति केंद्रन्यूनतम पार्श्व आंदोलन (± 4 मिमी) stereotaxic शून्य को प्राप्त करने के साथ कान सलाखों के बीच सिर के. प्रक्रिया में अगले कदम के लिए विकिरण तकनीक के लिए इस्तेमाल किया जा निर्धारित है. तीव्रता संग्राहक विकिरण (IMRT) चिकित्सा और volumetrically संग्राहक RapidArc के रूप में आर्क चिकित्सा (VMAT) 2 उच्च परिशुद्धता विकिरण तकनीकों है कि एक 6 एमवी फोटॉन बीम का उपयोग करने के लिए एक विकिरण खुराक 3-6 देने हैं . इन तकनीकों के बीच अंतर यह है कि IMRT एक खुराक बचाता कई स्थैतिक trajectories का उपयोग कर एक अलग दिशा से प्रत्येक इसी लेकिन लक्ष्य बेहद छोटे लक्ष्य मात्रा के लिए अधिक उपयुक्त मात्रा में converging. RapidArc दूसरे हाथ पर, एक खुराक गतिशील उद्धार एक या एक से अधिक लक्षित क्षेत्र (4 छवि) पर ध्यान केंद्रित आर्क्स के माध्यम से. प्रसव तकनीक, लक्ष्य खुराक पर जानकारी, लक्ष्य अनुरूप और महत्वपूर्ण अंगों को खुराक की कमी के बावजूद ECLIPSE में खुराक अनुकूलन विंडो में दर्ज किया जाना है. टीअंग संस्करणों के साथ साथ उसकी जानकारी खुराक वितरण दर्जी, जो लगातार विकिरण के दौरान किरण क्षीणन अलग द्वारा हासिल की है प्रयोग किया जाता है. एक बार एक योजना उत्पन्न किया गया, ECLIPSE परिकलित axial, राज्याभिषेक और बाण के समान (छवि 5) छवियों के रूप में अच्छी तरह के रूप में खुराक मात्रा हिस्टोग्राम (DVH) स्वरूप (छवि 6) में आरोपित खुराक प्रदान करता है. यह इस बिंदु पर जब योजना निर्धारित करने के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए अगर यह प्रसव या सुधार की जरूरत है के लिए उपयुक्त है. किरणन प्रक्रिया एक बार एक योजना प्रसव के लिए अनुमोदित किया गया था, डिजिटल खंगाला रेडियोग्राफ़ छवियाँ (DRR) ग्रहण में सीटी उपचार योजना डेटा से उत्पन्न किया गया. Orthogonal अस्थि घनत्व पर भारित खोपड़ी और अन्य बोनी स्थलों पर प्रकाश डाला छवियाँ हैं. इसके बाद, उपचार योजना और DRRs DICOM के माध्यम से उपचार वितरण कंप्यूटर प्रणाली के लिए भेजा जाता है. वितरण प्रणाली Varian त्रयी रैखिक त्वरक n नियंत्रणormally मनुष्य के रेडियोथेरेपी के लिए इस्तेमाल किया. त्वरक 120 कंप्यूटर नियंत्रित पतली multileaf (MLC) collimators और एक नैदानिक ​​गुणवत्ता इमेजिंग एक्स – रे पर बोर्ड इमेजिंग प्रणाली (ओ.बी.आई.) के भीतर शामिल प्रणाली के साथ सुसज्जित है. इस वितरण प्रणाली ECLIPSE विशिष्ट जानकारी अपलोड करता है और योजना बनाई खुराक देने के लिए त्वरक में समरेखक मापदंडों reconfigures है. चूहे इस बिंदु पर विकिरण के लिए तैयार किया गया था, बेहोश और एक कागज कंबल के साथ कवर करने के लिए इसे गर्म रखने के. कुछ ही मिनटों के बाद, उसके कंबल के साथ, लेकिन उजागर खोपड़ी के साथ चूहे, उपचार की मेज पर ही सीटी स्कैन उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया की स्थिति में रखा गया था. यह एक महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि स्थिति सटीकता सीधे खुराक वितरण में सटीकता के लिए सहसंबद्ध है. एक बार चूहा ठीक से उपचार की मेज पर तैनात किया गया था, orthogonal एक्स – रे छवियों का एक सेट त्रयी ओ.बी.आई. प्रणाली का उपयोग कर लिया है. उच्च संकल्प छवियों है कि बाद में ECLIPSE उत्पन्न जुड़े हुए थेघ DRRs ओ.बी.आई. छवि संलयन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर. एक्स – रे छवियों और DRRs डिजिटल सॉफ्टवेयर है कि तालिका स्थिति की पाली है कि छवियों के सह पंजीकरण (छवि 7) को प्राप्त करने के लिए किया जाना चाहिए पर जानकारी प्रदान का उपयोग मिलान किया गया. इस जानकारी की समीक्षा और पुष्टि है कि परिणामी पाली अनजाने त्वरक और उपचार टेबल के बीच किसी भी collisions में नेतृत्व नहीं करने के बाद, कंप्यूटर पाली लागू होता है और उपचार तालिका इच्छित स्थान पर स्वचालित रूप से चालें. इस बिंदु पर, विकिरण शुरू. 6 क्षेत्र IMRT योजना के साथ एक 10 Gy खुराक देने के लिए, पर समय बीम का लगभग 10 मिनट है, जबकि एक दो चाप RapidArc ~ 3 मिनट लगते हैं. उपचार के प्रसव के बाद पूरा हो गया है, चूहे उपचार के कमरे से हटा दिया गया था और एक होल्डिंग एक हीटिंग पैड पर रखा पिंजरे में ठीक करने की अनुमति दी. 3. अंतर hippocampal मानव स्टेम सेल का प्रत्यारोपण के लिए Stereotaxic सर्जरी एकnimals पालन और शल्य चिकित्सा की तैयारी इस अध्ययन के लिए, हम दो महीने पुरानी एटीएन राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (NIH-rnu तनाव 0N01 सीआर) से प्राप्त चूहों कार्यरत हैं. पशु बाँझ पिंजरों में रखा गया था और तापमान और प्रकाश नियंत्रित बाधा 12-h/12-h प्रकाश / अंधेरे चक्र के साथ एक वातावरण में बनाए रखा. चूहे autoclaved भोजन और पानी यथेच्छ प्रदान किया गया और देखभाल करने के लिए आँखें हर सप्ताह सफाई Vetropolycin आँख मरहम (पश्चिमी चिकित्सा आपूर्ति, Arcadia, CA) के साथ नेत्र संक्रमण को रोकने के लिया गया था. Stereotaxic सर्जरी के लिए, चूहों संज्ञाहरण कॉकटेल के एक आईपी इंजेक्शन (ketamine, 30 मिलीग्राम / किलो, xylazine, 2.5 मिलीग्राम / किलो और acepromazine, 1 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ anesthetized थे. पूर्ण संज्ञाहरण के बाद 10-15 मिनट और बेहोश करने की क्रिया स्पर्शनीय प्रतिवर्त (पैर की अंगुली चुटकी) का उपयोग करते हुए नजर रखी थी प्रेरित किया गया था. यदि सर्जरी के दौरान की आवश्यकता है, मूल खुराक के 15-20% के लिए पर्याप्त संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए दी जा सकती है है. बिजली क़ैंची का उपयोग सिर से फर निकालें. लगभगसर्जरी के क्षेत्र के 200% करने के लिए बाल द्वारा संक्रमण को रोकने के लिए मुंडा किया जाना चाहिए. साफ़ मुंडा providone / (3 बार) आयोडीन चीरा के पहले 70% शराब (3 बार) द्वारा बाद का उपयोग हिस्सा है. Stereotaxic सर्जरी Stereotaxic उपकरणों (डिजिटल मॉनिटर और फ्रेम), micromotor ड्रिल, शुष्क बिस्तर अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ और नियंत्रकों एक लामिना प्रवाह हुड में रखा जाना चाहिए एटीएन चूहों में सर्जरी प्रक्रिया के दौरान संभव संक्रमण को रोकने. एक एम्बेडेड हीटिंग पैड के साथ एक stereotaxic चरण के लिए सर्जरी के दौरान पशुओं को गर्म रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम सर्जरी thoughout Kimberly-क्लार्क Safeskin बैंगनी Nitrile बाँझ परीक्षा दस्ताने 'का इस्तेमाल किया. ये दस्ताने व्यक्तिगत बाँझ बैग में पैक कर रहे हैं (Cat. नहीं. 55,093). इसके अलावा, सर्जन 70% शराब स्प्रे का इस्तेमाल करने के लिए सर्जरी के दौरान हाथ बाँझ. कवर जानवर का उपयोग केवल सिर के साथ एक छोटी सी शल्य टांगना उजागर. Stereotaxic फ्रेम (बेंचमार्क डिजिटल, Leica myNeurolab) के भीतर मजबूती कान बा डालने से पशु सिर की स्थितिबाहरी कर्णद्वार में रु. अत्यधिक ध्यान रखना जब कान नहर में कान पट्टी की नोक फिसलने. छेनी बार चूहे के ऊपरी incisors hooking और मानक संदर्भ बिंदु के लिए पट्टी ऊंचाई का समायोजन करके रखें, तो नाक क्लंप कस लें. केंद्र न्यूनतम पार्श्व आंदोलन (± 4 मिमी) stereotaxic शून्य को प्राप्त करने के साथ कान सलाखों के बीच सिर की स्थिति. इन पोजीशनिंग कदम के बाद, सुखाने को रोकने के लिए और उन्हें संभव आयोडीन या शराब फैल से बचाने के लिए आँख से मरहम चिकनाई लागू होते हैं. इस मरहम सर्जरी के दौरान कम से कम 2 बार प्रयोग करें. खोपड़ी साथ बाँझ स्केलपेल का उपयोग midline त्वचा चीरा (2 सेमी), और बाँझ कपास का उपयोग करते हुए साफ applicator इत्तला दे दी. दुम का और गर्दन की मांसपेशियों क्षेत्रों में नुकसान से बचें. विदारक retractor का उपयोग करके, periosteum खुले और स्पष्ट कोमल ऊतक कपास इत्तला दे दी applicator का उपयोग कर पकड़ 1% हाइड्रोजन पेरोक्साइड (पीबीएस में बनाया) में डूबा हुआ है. रक्तस्राव को रोकने, कम से कम 1 मील के लिए फर्म दबाव बनाए रखनेn कपास का उपयोग applicator या धुंध इत्तला दे दी. फर्म scraping गति के लिए खोपड़ी और त्वचा के लिए dabbing गति को साफ लागू जब तक खोपड़ी sutures, ब्रैग्मा और लैम्ब्डा दिखाई दे रहे थे. सटीक stereotaxic निर्देशांक, पर्वबिन्दु को संदर्भित, चूहा मस्तिष्क एटलस 7 का उपयोग कर निर्धारित किया गया है. स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण प्रत्येक निम्नलिखित stereotaxic निर्देशांक का उपयोग गोलार्द्ध के लिए चार अलग स्थलों पर किया गया था: Anterio पीछे (एपी) ब्रैग्मा से 3.0 मिमी, medio पार्श्व (एमएल) के midline से 1.8mm, और dorso – वेंट्रल मस्तिष्क की सतह से 3.2mm (डीवी). एपी, 3.6 मिमी, एमएल, 2.5 मिमी, डीवी, 3.2 मिमी एपी, 4.2 मिमी, एमएल, 3.2 मिमी, डीवी, 3.2mm एपी, 4.2 मिमी, एमएल, 3.2 मिमी, डीवी, 3.2mm एक बार पर्वबिन्दु की पहचान की गई है, सभी तीन निर्देशांक (एपी, एमएल और DV) डिजिटल प्रदर्शन / नियंत्रक (डिजिटल stereotaxic फ्रेम पर) को चुना जाना चाहिए. तो सटीक प्रत्यारोपण (साइटों पूर्वगामी निर्देशांक का उपयोग निशान के लिए आगे बढ़ें) ठीक एक बिंदु मार्कर कलम के साथ फ्रेम पर एक छोटे से जांच धारक से जुड़ी है. पैर पेडल नियंत्रित micromotor ड्रिल (Leica myNeurolab) का उपयोग खोपड़ी के माध्यम से एक 0.35mm छेद ड्रिल (सिफारिश क्रमांक 1 / 4 दंत गड़गड़ाहट, कार्बाइड vanadium ड्रिल बिट). Dura झिल्ली को नुकसान को रोकने के लिए ध्यान रखना. यदि खून बह रहा ड्रिलिंग के दौरान होता है, फर्म दबाव कपास इत्तला दे दी applicator का उपयोग लागू होते हैं. ड्रिल साइट पर लागू न शराब या आयोडीन, के रूप में इस जानवर को जलन पैदा करेगा. चूहे 1 μL एक 5 μL हैमिल्टन microsyringe (30 गेज) का उपयोग कर की अधिकतम मात्रा में इंजेक्शन एनएससी के निलंबन के द्विपक्षीय अंतर hippocampal इंजेक्शन प्राप्त किया. इस खंड के भीतर कोशिकाओं की सटीक संख्या प्रयोगात्मक विशेष के अनुसार अलग अलग होंगे. यह पूरा करने के लिए, microsyringe stereotaxic फ्रेम पर एक छोटे से जांच धारक से जुड़ा था. मस्तिष्क की सतह (यानी meninges) तक पहुँचने तक ध्यान से खोपड़ी में सुई की नोक सम्मिलित करें. इस बिंदु पर, डीवी coordinaते डिजिटल / प्रदर्शन नियंत्रक पर चुना जाना चाहिए, फिर धीरे से वांछित गहराई (डीवी, 3.2 मिमी) सुई सम्मिलित. कक्षों की किसी भी इंजेक्शन की शुरुआत से पहले एक मिनट रुको. इंजेक्षन 0.25 μL मात्रा / मिनट एक टाइमर का उपयोग कर (धीमी गति से जारी). एक बार एक μL की कुल इंजेक्शन है, retracting सुई से पहले प्रत्यारोपण साइट से 8 मिनट रुको. इस समय के बाद, धीरे धीरे प्रत्यारोपण साइट (0.5 मिमी / मिनट) से सुई वापस लेना सुई ट्रैक के माध्यम से इंजेक्शन सामग्री का केशिका भाटा को रोकने के वापस. शेष प्रत्यारोपण साइटों (गोलार्द्ध प्रति 4) के लिए 3.2 कदम (जे) का पालन करें. खोपड़ी से त्वचा प्रत्याकर्षक निकालें और कुंद चिमटी का उपयोग करने के लिए धीरे वापस मुकर त्वचा को खींच और 4-5 बाँझ स्टेनलेस क्लिप लागू Autoclips शल्य सीवन applier (Leica myNeurolab) का उपयोग. फ्रेम से पशु हटाने के बाद, एनाल्जेसिक के साथ इंजेक्षन (Buprenorphin, 0.1 मिलीग्राम / किग्रा, अनुसूचित जाति, हर 12h) और घंटी समाधान lactated (5 mL/250 जी वयस्क चूहे, सुप्रीम कोर्ट). अपने पिंजरे में पशु वापस कि एक हीटिंग पैड पर रखा जाना चाहिए रखें. पशु मॉनिटर जब तक यह अपनी होल्डिंग के कमरे के लिए लौटने से पहले प्रति सचेत हो जाता है. प्लेस प्रत्येक जानवर पिंजरे में एक अलग पेट्री डिश में कुछ छर्रों (पशु चाउ) और transgel सिक्त. वैकल्पिक रूप से, DietGel रिकवरी (ClearH 2 हे, पोर्टलैंड, ME) पानी और पोषक तत्वों के एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. उनके वसूली समय के दौरान पशुओं को मॉनिटर और analgesia (buprenorphine 0.02 मिलीग्राम / किग्रा (2 दिनों के लिए हर 12h). लागू दर्द, संकट, लाल होना या सर्जरी साइट के संक्रमण के लक्षण के लिए जाँच करें / providone आयोडीन या neosporin मरहम बार दैनिक लागू करें (2 तक. -3) दिनों के लिए संभव संक्रमण को रोकने के है यदि संक्रमण, दर्द, या संकट के किसी भी लक्षण सर्जरी के 12 घंटे के भीतर एनाल्जेसिक या एंटीबायोटिक उपचार के बाद जारी रहती है तो पशु चिकित्सक से परामर्श या अधिक सहायता के लिए जानवरों की देखभाल के कर्मचारियों. 4. प्रतिनिधि परिणाम: iles/ftp_upload/3107/3107fig1.jpg "/> चित्रा 1 हमारे प्रायोगिक योजना के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. चित्रा 2 (बोनी शरीर रचना) सीटी और एमआरआई (कोमल ऊतक) ECLIPSE सॉफ्टवेयर के भीतर छवियों का फ्यूजन है . अक्षीय, राज्याभिषेक, और बाण के समान वर्गों के मिलान चूहे प्रत्येक इमेजिंग साधन से व्युत्पन्न मस्तिष्क की महत्वपूर्ण संरचनात्मक सुविधाओं का सह रजिस्ट्री के लिए अनुमति देते हैं. Figure 3. मस्तिष्क के hippocampal क्षेत्रों contoured. छवि संलयन के बाद, hippocampi और hippocampi छोड़कर मस्तिष्क की पहचान कर रहे हैं और अक्षीय रूप से इन अंगों के लिए विशिष्ट बड़ा क्षेत्रों परिभाषित contoured. इन क्षेत्रों में संरचनात्मक और मात्रा वांछित लक्ष्य (ओं) खुराक वितरण के समायोजन के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करते हैं. ure 4 "src =" files/ftp_upload/3107/3107fig4.jpg / "/> चित्रा 4 उच्च परिशुद्धता विकिरण विकल्प RapidArc के रूप में तीव्रता संग्राहक विकिरण (IMRT) चिकित्सा या volumetrically संग्राहक चाप थेरेपी (VMAT) का उपयोग . इन तकनीकों में देने 6 एमवी फोटॉन एकाधिक स्थैतिक trajectories है कि बहुत छोटे लक्ष्य वॉल्यूम पर एकाग्र कर सकते हैं के रूप में या तो मुस्कराते हुए (IMRT), या गतिशील रूप से एक या एक से अधिक लक्ष्य क्षेत्र (RapidArc) पर ध्यान केंद्रित आर्क्स के रूप में. चित्रा 5 ECLIPSE गणना axial छवियों के लिए आरोपित खुराक. दिखाया खुराक एकल या दोहरा hippocampi विकिरण उपचार योजना के लिए कर रहे हैं. चित्रा 6. ECLIPSE खुराक मात्रा हिस्टोग्राम गणना. डेटा गैर विकिरणित एकल hippoc तहत hippocampal मात्रा बनाम विकिरणित का प्रतिशत विरोधाभासोंampus उपचार योजना छवि में दिखाया गया है. 5. 7 चित्रा रेडियोथेरेपी के लिए छवि निर्देशित चूहे पोजीशनिंग. विषयेतर डिजिटल खंगाला रेडियोग्राफ़ (DRR) ग्रहण में सीटी उपचार योजना डेटा से उत्पन्न छवियों उपचार त्रयी पर बोर्ड इमेजिंग प्रणाली (ओ.बी.आई.) के साथ लिया मेज पर चूहे के orthogonal एक्स – रे छवियों के लिए जुड़े हुए हैं. DRRs अस्थि घनत्व है कि खोपड़ी और अन्य बोनी स्थलों जो ओ.बी.आई. की छवियों के साथ सह पंजीकरण की सुविधा पर प्रकाश डाला गया पर भारित कर रहे हैं. इन सेट के मिलान उपचार तालिका स्थिति की पाली है कि सीटी और एक्स – रे छवियों के सह पंजीकरण प्राप्त करने के लिए किया जाना चाहिए प्रदान करते हैं. 8 चित्रा stereotaxic सर्जरी के बाद प्रतिरोपित एनएससी स्थान. के बाद प्रत्यारोपण के एक महीने में, जानवरों perfused थे, दिमाग sectione थेघ और BrdU (प्रतिरोपित एनएससी का पता लगाने) और hematoxylin के साथ काउंटर दाग के साथ दाग. सुई ट्रैक (NT, लाल रेखा), महासंयोजिका (सीसी) के ठीक नीचे और CA1 ऊपर इंजेक्शन प्रक्षेपवक्र है कि साइट प्रत्यारोपण – रिलीज (Tr) पर एनएससी जमा इंगित करता है . प्रतिरोपित एनएससी Tr से मेजबान हिप्पोकैम्पस (दांतेदार hilus, DH, CA1 और CA3 उपक्षेत्रों, बढ़ाई x4 दांतेदार गाइरस, डीजी) भर में व्यापक प्रवास से पता चला है. स्केल बार, 200 सुक्ष्ममापी.

Discussion

काफी अनुसंधान चल तरीके के असंख्य है कि स्टेम सेल चिकित्सकीय इस्तेमाल किया जा सकता है क्षतिग्रस्त, वृद्ध ^और रोगग्रस्त 8 ऊतकों के सामान्य कार्यों को बहाल तलाश रही है. इन प्रयासों के अंतिम वसूली अद्वितीय microenvironments कि undamaged सामान्य ऊतकों से अलग कर रहे हैं के भीतर engrafted कोशिकाओं के व्यवहार की एक विस्तृत समझ की आवश्यकता होगी. हमारा काम दिखा दिया है कि विकिरणित ऊतक बिस्तर के भीतर cranially engrafted एनएससी कार्यात्मक अनुभूति है, जहां वे जीवित रहने, विस्थापित और तंत्रिका और ^glial दो प्रजातियों साथ अंतर को पुनर्स्थापित कर सकते हैं . संक्षेप में इन कोशिकाओं अनुभूति की वसूली कैसे मध्यस्थता वर्तमान में अनिश्चित है, लेकिन करता है एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके में सावधानी से नियंत्रित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला आयोजित करने पर निर्भर है. हम इन महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं विस्तृत यहाँ प्रतिकूल संज्ञानात्मक प्रभाव के साथ जुड़े ameliorating के लिए स्टेम सेल उपचार के translational क्षमता में तेजी लाने के प्रयासों मेंमस्तिष्क और कैंसर के अन्य रूपों के नैदानिक ​​प्रबंधन. अतिरिक्त विचार है कि डेटा की गुणवत्ता का एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो जाने की संभावना हैं के नीचे डाला जाता है.

ट्रांसप्लांटेशन आधारित चिकित्सा महत्वपूर्ण अभिकर्मक के रूप में स्टेम कोशिकाओं पर निर्भर करती है, और तदनुसार, देखभाल संस्कृतियों के लिए ठीक विशेषताएँ, बाँझपन बनाए रखने और परिणामों की विश्वसनीयता के लिए मिलान बीतने के नंबरों का उपयोग करने के लिए प्रयोग किया जाना चाहिए. प्रतिरोपित मानव स्टेम कोशिकाओं BrdU के साथ सर्जरी से पहले लेबल रहे थे, उन्हें vivo में नज़र रखने के लिए एक साधन उपलब्ध कराने के. हमारे प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, प्रतिरोपित एनएससी व्यापक प्रसार से गुजरना नहीं किया था, ताकि BrdU लेबल के कमजोर पड़ने समस्याग्रस्त नहीं था. वैकल्पिक रूप से, परमाणु मैट्रिक्स प्रोटीन (ज NUC या hNUMA) ⁹ या मानव विशिष्ट परमाणु प्रतिजन (HuNu) ² के रूप में मानव विशिष्ट मार्करों के लिए immunostaining प्रतिरोपित मानव स्टेम कोशिकाओं मेजबान कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. मानव स्टेम कोशिकाओं को भी साथ लेबल किया जा सकता है हैफ्लोरोसेंट मार्करों की एक किस्म मेजबान मस्तिष्क के भीतर उनकी पहचान की सुविधा के लिए.

ध्यान विकिरण पैरामीटर सटीक खुराक वितरण तकनीकों को परिभाषित करने के लिए, और उन यहाँ मॉडल विकिरण ऑन्कोलॉजी में वर्तमान नैदानिक ​​प्रथाओं का वर्णन किया. मस्तिष्क में स्टेम सेल के प्रत्यारोपण प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य भी महत्वपूर्ण है, और एक डिजिटल stereotaxic उपकरण का उपयोग कर पूरा. ठीक स्टेम सेल आरोपण के लिए हिप्पोकैम्पस जैसे छोटे मस्तिष्क संरचना में एक सूक्ष्म सिरिंज micromanipulate करने की क्षमता बहुत मानव त्रुटि को कम कर देता है. इस उपकरण के साथ, एनएससी चूहे हिप्पोकैम्पस के पीछे क्षेत्रों के लिए पूर्वकाल में फैले चार अलग साइटों में प्रत्यारोपित किया गया. Dorso वेंट्रल निर्देशांक (डीवी) athymic नग्न (एटीएन) ऐसी है कि शल्यचिकित्सा की प्रक्रियाओं ^hippocampal 2 गठन करने के लिए नुकसान का कारण नहीं होता चूहों के साथ अनुभव के आधार पर निर्धारित किया गया है. चूहे के मस्तिष्क के माध्यम से एक राज्याभिषेक अनुभाग hippocampal गठन incl की कुंजी संरचनाओं का पता चलता हैuding दांतेदार गाइरस (डीजी), (DH) दांतेदार hilus और CA1 और CA3 उपक्षेत्रों (8 छवि). प्रतिरोपित एनएससी, दिखाई सुई पथ (NT, redline) से पीछे की ओर से शुरू की, अव्यक्त रूप से धुंधला कोशिकाओं (भूरे रंग का) महासंयोजिका बस के नीचे प्रत्यारोपण रिलीज (Tr) साइट (सीसी), कि बाद में septo भर में प्रवास पर जमा के रूप में कल्पना कर रहे हैं हिप्पोकैम्पस के लौकिक अक्ष.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Digital Stereotaxic Instrument w/45° and 18° Earbars	Cranial transplantation surgical setup	Leica Microsystems (previously: MyNeuroLab)	39463501	Useful accessories: Stage with heater and variable current source (to maintain body temperature during surgery)