Tracking Morphogenetic Tissue Verformungen in der frühen Hühnerembryo
Summary
Dieser Artikel beschreibt Oberfläche Kennzeichnung und<em> Ex ovo</em> Gewebekultur in den frühen Hühnerembryo. Techniken zugänglich Zeitraffer-Hellfeld-, Fluoreszenz-und optischen Kohärenz-Tomographie dargestellt werden. Tracking-Oberfläche Etiketten mit hoher örtlicher und zeitlicher Auflösung ermöglicht kinematische Größen wie morphogenetic Stämme (Verformungen) in beiden zwei und drei Dimensionen berechnet werden.
Abstract
Embryonale Epithelien unterziehen komplexe Verformungen (z. B. Biegen, Drehen, Falten und Dehnung) auf die primitive Organe des frühen Embryos bilden. Tracking fiducial Markierungen auf der Oberfläche dieser Hohlkammerplatten ist eine gut etablierte Methode zur Schätzung der morphogenetischen Größen wie Wachstum, Schrumpfung und Scherung. Allerdings sind nicht alle Oberflächen Kennzeichnung Techniken ohne weiteres mit herkömmlichen bildgebenden Verfahren und besitzen unterschiedliche Vor-und Nachteile. Hier beschreiben wir zwei Kennzeichnung Methoden und illustrieren den Nutzen der einzelnen Verfahren. Bei der ersten Methode werden hunderte von fluoreszierenden Markierungen gleichzeitig auf den Embryo mit magnetischen Eisenteilchen angewendet. Diese Etiketten werden dann an Menge 2-D Gewebe Deformationen während der Morphogenese verwendet. In der zweiten Methode werden Polystyrol-Mikrosphären als Kontrastmittel in der nicht-invasiven optischen Kohärenztomographie (OCT) Bildgebung verwendet werden, um 3-D Gewebe Deformationen zu verfolgen. Diese Techniken wurden erfolgreichly in unserem Labor zu physikalischen Mechanismen der frühen Kopffalte, Herz und die Entwicklung des Gehirns studythe umgesetzt und sollte anpassungsfähig sein, um eine breite Palette morphogenetischen Prozessen.
Protocol
Discussion
Zwei Gewebe Kennzeichnung Techniken sind für die ex ovo Kultur der frühen Hühnerembryonen vorgestellt. Die erste nutzt fluoreszierende lipophile Farbstoffe über magnetische Eisenteilchen ausgeliefert, gleichzeitig label Hunderte von Zellen. Allerdings ist diese Methode derzeit nicht kompatibel mit optischen Kohärenztomographie, als Fluoreszenzfarbstoffe in der Regel wenig Kontrast aus den umliegenden Geweben unter Verwendung von 10 Oktober zeigen. Daher zeigen wir eine alternative Technik unter …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt R01 GM075200 und R01 HL083393 (LAT) unterstützt. Wir erkennen Gemeinschaft Unterstützung für BAF von NIH T90 DA022871 und die Mallinckrodt Institute of Radiology, und VDV aus gewähren 09PRE2060795 von der American Heart Association.
Materials
| Material / Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Sigma-Aldrich | P4083 | |
| Chicken Serum | Invitrogen | 16110-082 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X |
| Whatman #2 Filter Paper | Whatman | 1002 090 | 90mm diameter |
| Glass Micropipettes | World Precision Instruments (WPI) | TW150-6 | 1.5mm inner diameter |
| DiI | Invitrogen | D-282 | |
| Iron Reduced | Mallinckrodt Baker Inc. | 5320 | |
| 10 μm Diameter Microspheres (black) | Polysciences Inc. | 24294 | |
| Delta T Dish (for time lapse culture) | Bioptechs | 04200415B | 0.17mm thick, black |
| Delta T4 Culture Dish Controller | Bioptechs | 0420-4-03 | |
| Mini-Pump Variable Flow Device | Fisher Scientific |
References
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