단일 셀 RT - PCR 기법을 사용 Nigral 뉴런의 전압 - 문이 칼륨 채널 mRNA의 표현을 프로파일

요약

뉴런 먼저 electrophysiologically 특징입니다. 그런 다음 기록된 신경 세포의 세포질은 aspirated과 신경 전달 물질 합성 효소, 이온 채널, 수용체에 대한 mRNAs의 표현을 감지하기 위해 전사 - PCR 분석을 반대를 받게됩니다.

초록

포유류의 중추 신경계에서 다양한 분자 및 기능적 특성과 뉴런의 종류는 서로 분리하는 어렵고도 쉽게 자신의 형태에 의해 식별되지 함께 혼합된 있습니다. 그러므로, 그것은 특정 신경 세포 유형의 유전자 발현을 분석하는 것이 어렵습니다. 여기서 우리는 상당한 nigra의 신경 세포의 다른 유형의 프로파일 mRNA 표현에 단일 셀 리버스 전사 중합 효소의 연쇄 반응 (scRT - PCR)과 전체 세포 패치 클램프 녹음 기술을 결합하여 절차를 문서. Electrophysiological 기법 먼저 각 뉴런의 neurophysiological과 기능적 속성을 기록하는 데 사용됩니다. 그런 다음, 단일 electrophysiologically 특징 nigral 뉴런의 세포질은 aspirated과 신경 전달 물질 합성 효소, 수용체 및 이온 채널에 대한 mRNA 발현 프로파일을 얻기 위해 scRT - PCR 분석의 대상이됩니다. 높은 선택성 및 감도는 immunohistochemistry 인해 적절한 항체 또는 단백질의 낮은 표현 수준의 부족으로 사용할 수 없습니다 때이 방법은 특히 유용합니다. 이 방법은 다른 뇌 영역에서 뉴런에 적용됩니다.

프로토콜

1. 뇌 슬라이스 준비

1. 영은 (15-40일 세) 남성과 스프 - Dawley 쥐의 여성이 사용됩니다. (우리는 또한 생쥐에서이 같은 프로토콜을 사용합니다.) 깊이 우레탄 마취, 동물은 참수되고 머리가 빨리 밖으로 해부하는 것입니다. substantia nigra의 midrostral 일부를 포함하는 다음 300 μm의 두께 코로나 뇌 조각은 Leica vibratome (VT - 1200S)에 절단됩니다. 220 자당, 2.5 KCl, 1.25 아니 ₂ PO _4, 25 NaHCO _3, 0.5 CaCl _2, 7 MgCl _2, 10 D - 절차를 절단 슬라이스는 (MM)를 포함하는 솔루션을 절단 얼음처럼 차가운, 산소 높은 자당에서 수행됩니다 포도당. 그것은 95% 산소 유지하고 7.4의 산도를 유지하기 위해 O _{5분의 2} %의 CO _2의 혼합물과 함께 부풀어 오른 모양이다. 절단 솔루션 얼음처럼 차가운 절차를 통해 유지.
2. 125 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 아니 ₂ PO _4, 25 NaHCO _3, 2.5 CaCl _2, 1.3 MgCl ....

토론

scRT - PCR과 뇌 슬라이스의 패치 클램프 녹음의 조합은 우리가 여기 이온 채널, 수용체, 그리고 개별적 특징 뉴런의 신경 전달 물질 합성을위한 핵심 효소에 대한 mRNA 발현 프로파일을 조사하는 훌륭한 방법을 제공 보여주었다. (; 만주국 외 2009.. Surmeier 외 1996) 문제의 단백질이 발견과 같은 낮은 표현 수준 및 / 또는 적절한 항체의 부족으로 인해 immunohistochemistry 같은 다른 방법을 사용하여 현지 수없는 경우 특히 유용합니다. scRT - PCR의 높은 감도와 선택도가 낮은 풍요의 mRNAs (Surmeier 외. 1996)의 감지를 허용합니다. 또한이 방법은 수 개별적 특징 뉴런의 electrophysiological 및 기능 속성 (Liss 외 2001., 만주국 외 2008, 2009;. 딩 외 2011.)으로 유전자 발현의 상관 관계. 문학 증거와 경험을 바탕으로,이 방법은 신경 시스템의 모든 신경 세포 유형에 적용됩니다.

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재료

표 1. 주요 시약 및 장비

표 2. 쥐의의 연결 Kv3 채널, 티로신 hydroxylase (TH)와 glutamic 산 탈카복실화효소 1 (GAD1) ​​scRT - PCR을위한 mRNAs을 위해 뇌관 쌍