Perfiles de voltaje de expresión del ARNm de potasio en las neuronas Canal nigral con una sola celda de RT-PCR Técnicas
Summary
Las neuronas se caracterizan primera electrofisiológica. A continuación, el citoplasma de las neuronas registradas se aspira y se somete a la transcripción reversa-PCR y análisis para detectar la expresión de ARNm para enzimas síntesis de neurotransmisores, canales iónicos y receptores.
Abstract
En los mamíferos el sistema nervioso central, los diferentes tipos de neuronas con diversas características moleculares y funcionales se entremezclan entre sí difíciles otro, para separar y no se identifica fácilmente por su morfología. Por lo tanto, es a menudo difícil de analizar la expresión génica en un tipo de neurona específica. Aquí se documenta un procedimiento que combina células enteras patch clamp técnicas de grabación con una sola célula reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (SCRT-PCR) para el perfil de expresión de ARNm en los diferentes tipos de neuronas en el nigra sustancial. Técnicas electrofisiológicas se utilizó por primera vez para registrar las propiedades neurofisiológicas y funcional de las neuronas individuales. Entonces, el citoplasma de las neuronas individuales electrofisiológicamente caracteriza nigral se aspira y se somete a SCRT-PCR análisis para obtener los perfiles de expresión de ARNm de enzimas síntesis de neurotransmisores, receptores y canales iónicos. La alta selectividad y la sensibilidad que este método sea especialmente útil cuando la inmunohistoquímica no se pueden utilizar debido a la falta de anticuerpos adecuado o bajo nivel de expresión de la proteína. Este método también es aplicable a las neuronas de otras áreas del cerebro.
Protocol
Discussion
La combinación de la grabación de patch clamp en cortes de cerebro con SCRT-PCR hemos demostrado aquí proporcionan un excelente método para investigar los perfiles de expresión de mRNA de los canales iónicos, receptores y las enzimas clave para la síntesis de neurotransmisores en las neuronas caracteriza individualmente. Esto es particularmente útil cuando la proteína en cuestión no puede ser detectado y localizado por otros métodos como la inmunohistoquímica debido al bajo nivel de expresión y / o la falta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH R01DA021194 y R01NS058850.
Materials
Table 1. Key reagents and equipment
Table 2. Primer pairs for rat neuronal Kv3 channel, tyrosine hydroxylase (TH) and glutamic acid decarboxylase 1 (GAD1) mRNAs for scRT-PCR
References
- J, . Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription. EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).
- Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons. J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).
- Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons. J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).
- Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -. M. An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons. J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).
- Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons. J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).
- Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -. M. Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata. J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).
