تشريح المضيف للفيروسات التفاعل في النسخ المتماثل التحللي من الفيروسة الموديل
Summary
وصفنا بروتوكول لتحديد الأدوار الرئيسية للجزيئات إشارة المضيف في النسخ المتماثل للهربس التحللي نموذج، غاما هربس 68 (γHV68). استخدام سلالات الفئران المعدلة وراثيا والخلايا الليفية الجنينية لتكرار التحللي γHV68، وبروتوكول يسمح كل من توصيف المظهري والجزيئي للفيروس الاستجواب في استضافة التفاعلات في النسخ المتماثل التحللي الفيروسية.
Abstract
في استجابة للعدوى الفيروسية، مجموعة تطوير استجابات دفاعية مختلفة، مثل تفعيل المناعة الفطرية مسارات الإشارات التي تؤدي إلى 1،2 المضادة للفيروسات خلوى الإنتاج. من أجل استعمار المضيف والفيروسات هي تلزم للتهرب من الردود المضادة للفيروسات المضيف والتلاعب مسارات الإشارات. وكشف التفاعل المضيفة للفيروسات تسليط الضوء على وضع استراتيجيات علاجية جديدة ضد العدوى الفيروسية.
الفئران γHV68 يرتبط ارتباطا وثيقا هربس ساركومة المرتبطة الإنسان أنكجنيك كابوزي وEpsten بار فيروس 3،4. γHV68 العدوى في الفئران المعملية يوفر لين العريكة نموذج حيواني صغير لفحص كامل للاستجابات المضيف والعدوى الفيروسية في الجسم الحي، والتي هي غير متاحة للالهربس الإنسان. في هذا البروتوكول، نقدم لجنة من الأساليب لتوصيف المظهري والجزيئي للمكونات تشريح المضيفة في إشارة γHV68 replic التحلليأوجه كل من في الجسم الحي وفيفو السابقين. توافر سلالات الفئران المعدلة وراثيا يسمح استجواب أدوار مسارات الإشارات المضيف خلال العدوى الحادة γHV68 في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الماوس الخلايا الليفية الجنينية (MEFs) المعزولة من هذه السلالات الماوس ناقصة لتشريح مزيد من أدوار هذه الجزيئات خلال تكرار التحللي γHV68 فيفو السابقين.
باستخدام فحوصات الفيروسية البيولوجيا الجزيئية و، يمكننا تحديد الآلية الجزيئية للفيروسات من المضيف التفاعلات وتحديد المضيف والجينات الفيروسية الأساسية للنسخ المتماثل التحللي الفيروسية. وأخيرا، كروموسوم اصطناعي البكتيرية (BAC) نظام يسهل إدخال طفرات في عامل فيروسي (ق) التي يقطع على وجه التحديد التفاعل المضيفة للفيروسات. ويمكن استخدام المؤتلف γHV68 تحمل هذه الطفرات لاستعادة أحد الظواهر من تكرار التحللي γHV68 في MEFs نقص في إشارة المضيف مفتاح المكونات.هذا البروتوكول يوفر استراتيجية ممتازة لاستجواب المضيف الممرض التفاعل على مستويات متعددة للتدخل في الجسم الحي وفيفو السابقين.
مؤخرا، اكتشفنا أن يغتصب γHV68 على مسار الإشارات الفطرية في مأمن من تشجيع تكرار التحللي الفيروسية 5. على وجه التحديد، γHV68 العدوى نوفو دي ينشط المناعة، وكيناز IKKβ IKKβ تنشيط العامل الرئيسي phosphorylates النسخ الفيروسية، والنسخ وtransactivator (RTA)، لتعزيز تفعيل النسخي الفيروسية. في القيام بذلك، γHV68 الأزواج بكفاءة تفعيله النسخي لاستضافة تنشيط جهاز المناعة الفطرية، وبالتالي تيسير النسخ الفيروسية وتكرار التحللي. هذه الدراسة مثالا ممتازا التي يمكن تطبيقها على الفيروسات الأخرى لاستجواب المضيفة للفيروسات التفاعل.
Protocol
Discussion
في استجابة للعدوى الفيروسية، يتم تنشيط مافريكس التي تعتمد على المناعة الفطرية مسارات الإشارات لتعزيز إنتاج السيتوكينات الالتهابية المضادة للفيروسات 10-14. باستخدام γHV68 الفئران ك فيروس هربس ساركومة نموذجا للالمرتبطة الإنسان أنكجنيك كابوزي وفيروس ابشتاين بار <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور جيمس (تشى جيان) تشن (UT جنوبي غربي، البيولوجيا الجزيئية) لتوفير الكواشف الضرورية، بما في ذلك مافريكس – / – الفئران، والدكتور رينيه الشمس (جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس، والصيدلة الطب الجزيئي ) لتوفير كروموسوم البكتيريا الصناعي من γHV68 لهذه الدراسة.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 |
| Electro-MAX DH10B competent cells | Invitrogen | 18290-015 |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 |
| POWERPREP HP Plasmid Miniprep System | OriGene | NP100004 |
| POWERPREP HP Plasmid Midiprep System | OriGene | NP100006 |
References
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801 (2006).
- Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449, 819-826 (2007).
- Speck, S. H., Virgin, H. W. Host and viral genetics of chronic infection: a mouse model of gamma-herpesvirus pathogenesis. Curr. Opin. Microbiol. 2, 403-409 (1999).
- Speck, S. H., Ganem, D. Viral latency and its regulation: lessons from the gamma-herpesviruses. Cell Host Microbe. 8, 100-115 (2010).
- Dong, X. Murine gamma-herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to initiate lytic replication. PLoS Pathog. 6, e1001001-e1001001 (2010).
- Strauss, W. M., Ausubel, F. M. Preparation of genomic DNA from mammalian tissues. Current Protocols in Molecular Biology. , 2-2 (1998).
- Song, M. J. Identification of viral genes essential for replication of murine gamma-herpesvirus 68 using signature-tagged mutagenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 3805-3810 (2005).
- Hirt, B. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. J. Mol. Biol. 26, 365-369 (1967).
- Eva-Maria Borst, E., Crnkovic-Mertens, I., Messerle, M., Zhao, S., Stodolsky, M. Cloning of β-herpesvirus genomes as bacterial artificial chromosomes. Methods in Molecular Biology. , 256-256 (2004).
- Sun, Q. The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses. Immunity. 24, 633-642 (2006).
- Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122, 669-682 (2005).
- Kawai, T. IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction. Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).
- Meylan, E. Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus. Nature. 437, 1167-1172 (2005).
- Xu, L. G. VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling. Mol. Cell. 19, 727-740 (2005).
