Scheiding van enkelstrengs DNA, dubbelstrengs DNA en RNA van een milieu-Viral Gemeenschap met behulp van Hydroxyapatite Chromatografie
Summary
Beschrijven we een efficiënte methode om enkelstrengs DNA, double-stranded DNA-en RNA-moleculen te scheiden van het milieu virale gemeenschappen. Nucleïnezuren worden gefractioneerd met behulp van hydroxyapatiet chromatografie met toenemende concentraties van fosfaat-bevattende buffers. Deze methode laat de isolatie van alle virale nucleïnezuur types van het milieu monsters.
Abstract
Virussen, in het bijzonder bacteriofagen (fagen) zijn de meest talrijke biologische entiteiten op Aarde 1,2. Virussen moduleren gastheercel overvloed en diversiteit een bijdrage leveren aan de recycling van voedingsstoffen, veranderen gastheercel fenotype, en beïnvloedt de ontwikkeling van zowel de gastheercel en virale gemeenschappen via de laterale overdracht van genen 3. Talrijke studies hebben gewezen op de onthutsend genetische diversiteit van virussen en hun functionele mogelijkheden in een verscheidenheid van natuurlijke omgevingen.
Metagenomic technieken zijn gebruikt om de taxonomische diversiteit en functionele mogelijkheden van complexe virale assemblages, waarvan de leden bevatten enkelstrengs DNA (ssDNA), dubbelstrengs DNA (dsDNA) en RNA genotypen 4-9 te bestuderen. Huidige bibliotheek bouw-protocollen gebruikt om de milieu-DNA bevatten of RNA-bevattende virussen studie vereisen een eerste nuclease behandeling om te verwijderen nontargeted sjablonen 10. Echter, een beter begrip van het collectieve gen complement van het virus gemeenschap en virus diversiteit vraagt om kennis van alle leden, ongeacht genoom samenstelling. Fractionering van gezuiverd nucleïnezuur subtypes biedt een effectief mechanisme om virale assemblages bestuderen zonder in te boeten een subset van de genetische van de gemeenschap handtekening.
Hydroxyapatiet, een kristallijne vorm van calciumfosfaat, is werkzaam in de scheiding van nucleïnezuren, evenals eiwitten en microben, sinds de jaren 1960 11. Door gebruik te maken van de lading interactie tussen de positief geladen Ca 2 + ionen van het hydroxyapatiet en de negatief geladen fosfaat ruggengraat van het nucleïnezuur subtypen, is het mogelijk om bij voorkeur elueren elk nucleïnezuur subtype onafhankelijk van de anderen. We hebben onlangs in dienst van deze strategie om zelfstandig te fractioneren van de genomen van ssDNA, dsDNA-en RNA-bevattende virussen ter voorbereiding van de DNA-sequencing 12. Hier presenteren we een methode voor de fractionering en herstel van de ssDNA, dsDNA-en RNA-virale nucleïnezuren uit gemengde virale assemblages met behulp van hydroxyapatiet chromotografie.
Protocol
Discussion
De hydroxyapatiet chromatografie methodiek hier wordt gepresenteerd is een zeer efficiënte en robuuste hulpmiddel voor de fractionering van nucleïnezuren uit gemengde virale assemblages, wanneer het doel is het bestuderen van de totale nucleïnezuur samenstelling van de gemeenschap. In het algemeen zal ssDNA, RNA en dsDNA elueren uit de kolom pho fosfaatbuffer concentraties hoger dan ongeveer ~ 0en 0,40 m respectievelijk. Echter, elke bereiding van hydroxyapatiet hebben een iets andere samenstelling en elutie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door de Office of Science (BER), US Department of Energy, samenwerkingsovereenkomst nee. De-FC02-02ER63453, Microbiële het genoom van de National Science Foundation Sequencing Program (award nummers 0626826 en 0731916). Wij danken John Glass voor zijn technische expertise en advies en K. Eric Wommack voor zijn hulp bij het milieu monstername.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Catalogue Number |
|---|---|---|---|
| Econo-Column | Bio-Rad | 737-0717 | 0.7cm ID package/2 |
| Hydroxyapatite | Bio-Rad | 130-0520 | DNA Grade Bio-Gel HTP Gel, 100g/td> |
| Sodium Phosphate, Monobasic | VWR | VW1497-01 | Monohydrate, Crystal 500g |
| Sodium Phosphate, Dibasic | VWR | VW1496-01 | Anhydrous, Powder 500g |
| DEPC-treated Water | Invitrogen | AM9922 | 1L |
| 10% SDS Solution | Invitrogen | 24730-020 | UltraPure, 1L |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9262 | pH 8.0, 1L |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| 2ml serological pippette | VWR | 89130-884 | Polystyrene, Sterile |
| BD Falcon Centrifuge Tubes | VWR | 21008-936 | 15ml, Sterile |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1 v/v/v) | Invitrogen | 15593-031 | UltraPure, 100ml |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Device | Millipore | UFC803024 | Ultracel-30 membrane |
| 20X TE Buffer, Rnase free | Invitrogen | T11493 | 100ml |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15mg/ml |
References
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The Unseen Majority. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).
- Hendrix, R. W. Bacteriophages: evolution of the majority. Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).
- Weinbauer, M. G. Bacteriophages: Evolution of the Majority. FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).
- Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes. Nature. 455, 830-830 (2008).
- McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression. PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).
- Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples. PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).
- Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. RNA Viruses in the Sea. FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).
- Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics. J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).
- Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics. J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).
- Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities. Science. 312, 1795-1795 (2006).
- Bernardi, G. Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite. Nature. 209, 779-779 (1965).
- Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages. Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).
- Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems. Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).
