Séparation de l'ADN simple brin, double brin de l'ADN et l'ARN à partir d'un environnement communautaire viral en utilisant chromatographie d'hydroxyapatite
Summary
Nous décrivons une méthode efficace pour séparer l'ADN simple brin, double brin de l'ADN et des molécules d'ARN à partir de l'environnement communautés virales. Les acides nucléiques sont fractionnés par chromatographie d'hydroxyapatite avec des concentrations croissantes de phosphate contenant du tampon. Cette méthode permet l'isolement de tous les types d'acides nucléiques viraux dans des échantillons environnementaux.
Abstract
Les virus, en particulier les bactériophages (phages), sont les entités biologiques les plus nombreux sur 1,2 Terre. Les virus de moduler l'abondance et la diversité de la cellule hôte, contribuent à le cycle des nutriments, de modifier l'hôte phénotype cellulaire, et l'influence de l'évolution de la cellule hôte et communautés virales à travers le transfert latéral des gènes 3. De nombreuses études ont mis en évidence la diversité stupéfiante génétique des virus et leur potentiel fonctionnel dans une variété de milieux naturels.
Techniques de métagénomique ont été utilisés pour étudier la diversité taxonomique et fonctionnelle des complexes potentiels assemblages viraux dont les membres contiennent l'ADN simple brin (ADNsb), l'ADN double brin (ADNdb) et les génotypes ARN 4-9. Les protocoles actuels de construction de bibliothèques utilisées pour étudier l'ADN ou d'ARN contenant l'environnement contenant des virus nécessitent un traitement initial nucléase afin d'éliminer les modèles non ciblées 10. Cependant, une compréhension globale de l'effectif du gène collective de la communauté du virus et la diversité du virus nécessite la connaissance de tous les membres indépendamment de la composition du génome. Le fractionnement des sous-types d'acides nucléiques purifiés fournit un mécanisme efficace par lequel l'étude des assemblages virale sans sacrifier une partie de la signature génétique de la communauté.
Hydroxyapatite, une forme cristalline du phosphate de calcium, a été employé dans la séparation des acides nucléiques, ainsi que des protéines et des microbes, depuis les années 1960 11. En exploitant l'interaction entre les responsables chargés positivement ions Ca 2 + de l'hydroxyapatite et le squelette phosphate chargé négativement des sous-types d'acides nucléiques, il est possible d'éluer préférentiellement chaque sous-type acide nucléique indépendant des autres. Nous avons récemment utilisé cette stratégie de manière indépendante fractionner les génomes de ADNsb, et de l'ARN-ADN double brin contenant des virus dans la préparation du séquençage de l'ADN 12. Ici, nous présentons une méthode pour le fractionnement et la récupération des ADNsb, ADNdb et l'ARN viral à partir d'acides nucléiques viraux assemblages mixtes utilisant chromatographie d'hydroxyapatite.
Protocol
Discussion
La méthodologie présentée ici chromatographie d'hydroxyapatite est un outil très efficace et robuste pour le fractionnement des acides nucléiques à partir des assemblages mixtes virales, lorsque l'objectif est d'étudier la composition des acides nucléiques totaux de la communauté. Généralement, ADNsb, ARN et ADN double brin sera élue de la colonne de concentration pho tampon phosphate supérieure à environ 0,40 m ~ 0et respectivement. Cependant, chaque préparation d'hydroxyapatite …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par l'Office of Science (BER), Département américain de l'Énergie, Accord de coopération non. De-FC02-02ER63453, la National Science Foundation Programme de séquençage du génome microbien (numéros 0,626,826 et 0,731,916 prix). Nous remercions John Glass pour son expertise technique et des conseils et K. Eric Wommack pour son aide dans la collecte des échantillons environnementaux.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Catalogue Number |
|---|---|---|---|
| Econo-Column | Bio-Rad | 737-0717 | 0.7cm ID package/2 |
| Hydroxyapatite | Bio-Rad | 130-0520 | DNA Grade Bio-Gel HTP Gel, 100g/td> |
| Sodium Phosphate, Monobasic | VWR | VW1497-01 | Monohydrate, Crystal 500g |
| Sodium Phosphate, Dibasic | VWR | VW1496-01 | Anhydrous, Powder 500g |
| DEPC-treated Water | Invitrogen | AM9922 | 1L |
| 10% SDS Solution | Invitrogen | 24730-020 | UltraPure, 1L |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9262 | pH 8.0, 1L |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| 2ml serological pippette | VWR | 89130-884 | Polystyrene, Sterile |
| BD Falcon Centrifuge Tubes | VWR | 21008-936 | 15ml, Sterile |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1 v/v/v) | Invitrogen | 15593-031 | UltraPure, 100ml |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Device | Millipore | UFC803024 | Ultracel-30 membrane |
| 20X TE Buffer, Rnase free | Invitrogen | T11493 | 100ml |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15mg/ml |
References
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The Unseen Majority. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).
- Hendrix, R. W. Bacteriophages: evolution of the majority. Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).
- Weinbauer, M. G. Bacteriophages: Evolution of the Majority. FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).
- Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes. Nature. 455, 830-830 (2008).
- McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression. PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).
- Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples. PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).
- Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. RNA Viruses in the Sea. FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).
- Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics. J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).
- Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics. J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).
- Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities. Science. 312, 1795-1795 (2006).
- Bernardi, G. Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite. Nature. 209, 779-779 (1965).
- Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages. Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).
- Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems. Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).
