Trennung von Einzelstrang-DNA, doppelsträngige DNA und RNA aus ökologischer Viral Gemeinschaft mit Hydroxyapatit-Chromatographie
Summary
Wir beschreiben eine effiziente Methode, um Einzelstrang-DNA, doppelsträngige DNA-und RNA-Molekülen aus Umwelt-virale Gemeinden zu trennen. Nukleinsäuren sind fraktionierte mit Hydroxyapatit-Chromatographie mit steigenden Konzentrationen von Phosphat-haltigen Puffer. Diese Methode erlaubt die Isolierung aller viralen Nukleinsäure-Typen aus Umweltproben.
Abstract
Viren, vor allem Bakteriophagen (Phagen), sind die zahlreichen biologischen Einheiten auf der Erde 1,2. Viren modulieren Wirtszelle Fülle und Vielfalt, um den Kreislauf der Nährstoffe beitragen, zu verändern Wirtszelle Phänotyp, und Einfluss auf die Entwicklung der beiden Wirtszelle und Virus-Communities durch die seitlichen Transfer von Genen 3. Zahlreiche Studien haben die erstaunliche genetische Vielfalt der Viren und ihre funktionelle Potenzial in einer Vielzahl von natürlichen Umgebungen hervorgehoben.
Metagenom Techniken wurden verwendet, um die taxonomische Diversität und funktionale Potenzial von komplexen viralen Assemblagen, deren Mitglieder enthalten Einzelstrang-DNA (ssDNA), doppelsträngige DNA (dsDNA) und RNA-Genotypen 4-9 studieren. Aktuelle Bibliothek Bau-Protokolle verwendet werden, um Umwelt-DNA-haltigen oder RNA-Viren enthalten Studie erfordern eine erste Nuklease Behandlung zur Entfernung nontargeted Templates 10. Allerdings erfordert ein umfassendes Verständnis des kollektiven Gen Ergänzung des Virus-Community und Viren Vielfalt Wissen aller Mitglieder, unabhängig von Genom Zusammensetzung. Die Fraktionierung des gereinigten Nukleinsäure-Subtypen bietet einen wirksamen Mechanismus, durch die virale Assemblagen, ohne dabei eine Teilmenge der Gemeinde genetische Signatur zu studieren.
Hydroxyapatit, eine kristalline Form von Calciumphosphat, hat in der Trennung von Nukleinsäuren, sowie Proteine und Mikroben eingesetzt worden, seit den 1960er Jahren 11. Durch die Ausnutzung der Ladungs-Wechselwirkung zwischen den positiv geladenen Ca 2 +-Ionen des Hydroxylapatit und der negativ geladenen Phosphat-Rückgrat der Nukleinsäure-Subtypen, ist es möglich, bevorzugt eluieren jede Nukleinsäure-Subtyp unabhängig von den anderen. Vor kurzem haben wir diese Strategie, unabhängig fraktionieren die Genome von ssDNA, dsDNA und RNA-Viren enthalten in der Vorbereitung der DNA-Sequenzierung 12 verwendet. Hier stellen wir ein Verfahren zur Fraktionierung und Rückgewinnung von ssDNA, dsDNA und RNA viralen Nukleinsäuren aus gemischten virale Assemblagen mit Hydroxyapatit-Chromatographie.
Protocol
Discussion
Die Hydroxyapatit-Chromatographie-Methodik präsentiert hier ist eine hocheffiziente und robustes Werkzeug für die Fraktionierung von Nukleinsäuren aus gemischten virale Assemblagen, wenn das Ziel, die gesamte Nukleinsäure Zusammensetzung der Gemeinde-Studie ist. Im Allgemeinen wird ssDNA, RNA und dsDNA aus der Spalte pho-Phosphat-Puffer-Konzentrationen von mehr als etwa ~ 0und 0,40 M bzw. eluieren. Allerdings kann jeder Zubereitung von Hydroxyapatit haben eine etwas andere Zusammensetzung und Elutionsprofil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Office of Science (BER), US Department of Energy, Cooperative Agreement nicht unterstützt. De-FC02-02ER63453, die National Science Foundation Mikrobielle Genome Sequencing Program (Auszeichnung Zahlen 0626826 und 0731916). Wir danken John Glass für seine technische Kompetenz und Beratung und K. Eric Wommack für seine Unterstützung bei der Umwelt-Probenentnahme.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Catalogue Number |
|---|---|---|---|
| Econo-Column | Bio-Rad | 737-0717 | 0.7cm ID package/2 |
| Hydroxyapatite | Bio-Rad | 130-0520 | DNA Grade Bio-Gel HTP Gel, 100g/td> |
| Sodium Phosphate, Monobasic | VWR | VW1497-01 | Monohydrate, Crystal 500g |
| Sodium Phosphate, Dibasic | VWR | VW1496-01 | Anhydrous, Powder 500g |
| DEPC-treated Water | Invitrogen | AM9922 | 1L |
| 10% SDS Solution | Invitrogen | 24730-020 | UltraPure, 1L |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9262 | pH 8.0, 1L |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| 2ml serological pippette | VWR | 89130-884 | Polystyrene, Sterile |
| BD Falcon Centrifuge Tubes | VWR | 21008-936 | 15ml, Sterile |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1 v/v/v) | Invitrogen | 15593-031 | UltraPure, 100ml |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Device | Millipore | UFC803024 | Ultracel-30 membrane |
| 20X TE Buffer, Rnase free | Invitrogen | T11493 | 100ml |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15mg/ml |
References
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