Separation av enda DNA, dubbel-strängat DNA och RNA ur miljösynpunkt Viral gemenskapen med hjälp av hydroxyapatit Kromatografi
Summary
Vi beskriver en effektiv metod att separera enda DNA, dubbelsträngat DNA och RNA-molekyler från miljö-virus samhällen. Nukleinsyror är fraktionerade med hydroxyapatit kromatografi med ökande koncentrationer av fosfat som innehåller buffertar. Denna metod medger isolering av alla virus-nukleinsyra typer från miljöprover.
Abstract
Virus, särskilt bakteriofager (fager), är de mest talrika biologiska enheter på jorden 1,2. Virus modulera överflöd värdcellen och mångfald, bidrar till omsättning av näringsämnen, förändra värdcellens fenotyp, och påverka utvecklingen av både värdcell och virus samhällen genom den laterala överföring av gener 3. Ett flertal studier har lyft fram häpnadsväckande genetiska mångfalden av virus och deras funktionella potential i en mängd olika naturliga miljöer.
Metagenomic tekniker har använts för att studera den taxonomiska mångfald och funktionella potential av komplexa virus sammansättningar vars ledamöter innehålla enda DNA (ssDNA), dubbel-strängat DNA (dsDNA) och RNA-genotyper 4-9. Nuvarande bibliotek konstruktion protokoll som används för att studera miljö-DNA-innehållande eller RNA som innehåller virus kräver en initial nukleas behandling för att avlägsna nontargeted mallar 10. Kräver dock en omfattande förståelse av den kollektiva genen komplement av viruset gemenskapen och virus mångfald kunskap om alla medlemmar oberoende av genomet sammansättning. Fraktionering av renat nukleinsyra subtyper ger en effektiv mekanism för att studera virus assemblage utan att offra en del av samhällets genetiska signatur.
Hydroxyapatit, en kristallin form av kalciumfosfat, har varit anställd vid separation av nukleinsyror, samt proteiner och mikrober, sedan 1960-talet 11. Genom att utnyttja den avgift samspelet mellan de positivt laddade Ca 2 + joner av hydroxyapatit och negativt laddade fosfat ryggraden av nukleinsyra subtyper, är det möjligt att företrädesvis eluera varje nukleinsyra subtyp oberoende av de andra. Vi arbetar nyligen denna strategi att självständigt fraktioneras av genomen hos ssDNA, dsDNA och RNA-innehållande virus i beredningen av DNA-sekvensering 12. Här presenterar vi en metod för fraktionering och återvinning av ssDNA, dsDNA och RNA-virus nukleinsyror från blandade virus assemblage med hydroxyapatit chromotography.
Protocol
Discussion
Hydroxyfosfaten kromatografi metoden som presenteras här är ett mycket effektivt och robust verktyg för fraktionering av nukleinsyror från blandade virus assemblage, när målet är att studera den totala nukleinsyra sammansättningen av samhället. I allmänhet kommer ssDNA, RNA och dsDNA rinna genom kolonnen Pho fosfatbuffert högre koncentrationer än cirka ~ grundljusnivån från 0 0,40 m respektive. Däremot kan varje beredning av hydroxyapatit har en något annorlunda sammansättning och elueringstid …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöds av Office of Science (BER), US Department of Energy, samarbetsavtal nej. De-FC02-02ER63453, National Science Foundations Mikrobiell genomsekvenseringsprojekt programmet (tilldelning nummer 0.626.826 och 0.731.916). Vi tackar John Glas för sin tekniska expertis och rådgivning och K. Eric Wommack för hans hjälp med miljö-provtagning.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Catalogue Number |
|---|---|---|---|
| Econo-Column | Bio-Rad | 737-0717 | 0.7cm ID package/2 |
| Hydroxyapatite | Bio-Rad | 130-0520 | DNA Grade Bio-Gel HTP Gel, 100g/td> |
| Sodium Phosphate, Monobasic | VWR | VW1497-01 | Monohydrate, Crystal 500g |
| Sodium Phosphate, Dibasic | VWR | VW1496-01 | Anhydrous, Powder 500g |
| DEPC-treated Water | Invitrogen | AM9922 | 1L |
| 10% SDS Solution | Invitrogen | 24730-020 | UltraPure, 1L |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9262 | pH 8.0, 1L |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| 2ml serological pippette | VWR | 89130-884 | Polystyrene, Sterile |
| BD Falcon Centrifuge Tubes | VWR | 21008-936 | 15ml, Sterile |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1 v/v/v) | Invitrogen | 15593-031 | UltraPure, 100ml |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Device | Millipore | UFC803024 | Ultracel-30 membrane |
| 20X TE Buffer, Rnase free | Invitrogen | T11493 | 100ml |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15mg/ml |
References
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The Unseen Majority. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).
- Hendrix, R. W. Bacteriophages: evolution of the majority. Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).
- Weinbauer, M. G. Bacteriophages: Evolution of the Majority. FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).
- Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes. Nature. 455, 830-830 (2008).
- McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression. PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).
- Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples. PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).
- Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. RNA Viruses in the Sea. FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).
- Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics. J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).
- Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics. J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).
- Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities. Science. 312, 1795-1795 (2006).
- Bernardi, G. Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite. Nature. 209, 779-779 (1965).
- Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages. Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).
- Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems. Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).
