FlexStation 3을 사용 TRP 채널 기능의 높은 처리량 검사하는 매체를위한 셀 기반의 칼슘 분석
Summary
이 동영상은 FlexStation 3을 사용 인간 TRPA1 채널의 약리 프로필을 공부에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜은 세포 준비, 염료 로딩과 microplate 리더 FlexStation 3 작업의 세부 사항을 다룹니다.
Abstract
분자 장치 'FlexStation 3 멀티 잘 접시에 자동 형광 측정 가능한 benchtop 다중 모드 microplate 리더입니다. 그것은 학술 설정에서 중간에 높은 처리량 화면에 이상적입니다. 그것은 멀티 채널 pipetter과 기계가 형광 시약의 다양한 형광 변화를 모니터링하기 위해 한 번에 한 컬럼을 읽고 갖춘 통합 유체 전송 모듈이 있습니다. 예를 들어, FlexStation 3 + – 투과 이온 채널과 G 단백질 결합 수용체 세포 무료 칼슘 2 + 수준의 변화를 측정하여 칼슘 2의 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 과도 수용체 잠재적인 (TRP) 채널은 많은 생리와 pathophysiological 기능에 중요한 역할을 nonselective 양이온 채널의 큰 가족입니다. TRP 채널의 대부분은 칼슘 투과하고 활성화시 칼슘 유입을 유도. 이 비디오에서는, 우리는 TRPA1 채널, 다양한 유해 자극에 대해 분자 센서의 약리 프로필을 공부 FlexStation 3 응용 프로그램을 보여줍니다. transiently 또는 안정 96 – 웰 플레이트에서 자란 인간 TRPA1 채널을, 표현 HEK293 세포가 + 민감한 형광 염료 칼슘 2, Fluo – 4, 이러한 세포의 실시간 형광 변경 로드된은의 적용 전과하는 동안 측정 FlexStation 3 플렉스 모드를 사용하여 TRPA1 아고 니스트. putative TRPA1 길항제의 영향도 조사했다. 데이터는 TRPA1 activators와 억제제의 농도 – 반응 관계를 구축하기 위해 SoftMax Pro 소프트웨어에서 전송됩니다.
Protocol
Discussion
세포내 칼슘 2 +과 같은 신경 전달 물질 릴리즈 (3), 심장 활동 전위 (4), 근육 세포 수축 (5), 세포 신호 전달 (6-7) 및 excitotoxic 세포 죽음 (많은 생리와 병리 학적 조건에서 중요한 역할을 담당 8). 세포내 칼슘 2 + 수준의 측정 기능 + – 투과 채널 플라즈마 막이나 세포 organelles에서 칼슘 2의 변화와 공헌을 명료하게하다하는 데 도움이
위의 프로세스 (9-13)에 CA 2 +…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 DRS 감사합니다. 존 핸콕, 레이 그릴, 앤드류 모리스과 지원 올가 Chumakova. FlexStation 3 시스템은 UTHSC Cytodynamic 이미징 시설의 일부입니다. 우리는 또한 DRS 감사합니다. 스크립스 연구소와 HEK293 – hTRPA1 안정 세포주를 제공 노바티스 연구 재단 (GNF)의 게놈 연구소에서 Ardem Patapoutian 마이클 Bandell. 연구는 NIH (MXZ에 GM081658)와 텍사스 메디컬 센터 소화기 질환 센터 (HH)을하고 미션 연결 / TIRR 재단 (HH로)에서 부여로 일부에서 지원됩니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| FlexStation 3 | Molecular Devices | FLEX3 | |
| 96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
| 96-Well Plates | Greiner Bio-one | 655090 | |
| 96-Well Clear Flat Bottom plates | Costar | 3595 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14202 | |
| PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P36551 | |
| probenecid | Sigma | P8761 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418 |
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