Concentration des métabolites issus de communautés planctoniques à faible densité de l'environnement en utilisant métabolomique résonance magnétique nucléaire
Summary
Une méthode pour l'extraction de métabolite communautés planctoniques microbiens est présenté. Échantillonnage ensemble de la communauté est réalisée par filtration sur des filtres spécialement préparés. Après lyophilisation, aqueuse-solubles métabolites sont extraits. Cette approche permet une application de la métabolomique environnementaux trans-omique enquêtes de communautés microbiennes naturelles ou expérimentales.
Abstract
L'environnement métabolomique est un domaine émergent qui est de promouvoir la compréhension nouvelle dans la façon dont les organismes de répondre et d'interagir avec l'environnement et l'autre au niveau biochimique 1. La résonance magnétique nucléaire (RMN) est l'un de plusieurs technologies, y compris chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS), avec la promesse considérable pour de telles études. Avantages de la RMN est qu'il est adapté à des analyses non ciblées, fournit des informations structurelles et les spectres peuvent être interrogés de façon quantitative et statistique des bases de données récemment disponibles contre des spectres métabolite individuelle 2,3. En outre, les données spectrales de RMN peuvent être combinées avec des données provenant d'autres niveaux omique (transcriptomique, par exemple, la génomique) pour fournir une compréhension plus complète des réponses physiologiques des taxons les uns aux autres et l'environnement 4,5,6. Cependant, la RMN est moins sensible que d'autres techniques de métabolomique, ce qui rend difficile à apnappe à des systèmes microbiens naturels où les populations d'échantillons peuvent être concentrations de faible densité et de son métabolite faibles par rapport à des métabolites de bien défini et facilement extractibles sources telles que les tissus entiers, ou de cellules biofluides-cultures. Par conséquent, les quelques directs sur l'environnement métabolomique de microbes réalisées à ce jour ont été limitées à la culture à base de ou facilement définies à haute densité tels que les écosystèmes d'accueil-symbiotes systèmes, construits co-cultures ou des manipulations de l'environnement intestin, où l'étiquetage des isotopes stables peuvent être en outre utilisé pour amplifier les signaux de RMN 7,8,9,10,11,12. Les méthodes qui facilitent la concentration et la collecte des métabolites de l'environnement à des concentrations appropriées pour la RMN font défaut. Depuis l'attention récente a été donnée aux métabolomique de l'environnement d'organismes dans le milieu aquatique, où une grande partie du flux d'énergie et des matériaux est médiée par la communauté planctonique 13,14, nous avons développé une méthode pour la concentrationtion et l'extraction de l'ensemble de la communauté-métabolites de systèmes microbiens planctoniques par filtration. Disponibles dans le commerce hydrophiles poly-1 ,1-difluoroéthylène (PVDF) filtres sont spécialement traitées pour supprimer complètement extractibles, ce qui peut apparaître autrement en tant que contaminants dans les analyses ultérieures. Ces filtres traités sont ensuite utilisés pour filtrer des échantillons environnementaux ou expérimentaux d'intérêt. Filtres contenant l'échantillon humide sont lyophilisée et une solution aqueuse-solubles métabolites sont extraits directement de la spectroscopie RMN classique en utilisant un tampon phosphate de potassium standardisé d'extraction 2. Données issues de ces méthodes peuvent être analysées statistiquement pour identifier les tendances significatives, ou intégrée à d'autres niveaux omique pour la compréhension globale de la communauté et la fonction des écosystèmes.
Protocol
Discussion
La méthode d'extraction de filtration et de son métabolite démontré ici permet de biomasse planctonique microbienne être collectées en quantité suffisante pour la métabolomique RMN. Bien que l'extraction d'une solution aqueuse ne solubles métabolites en utilisant des KPI et 1D 1 H RMN est démontrée, les solvants d'extraction d'autres approches et spectroscopiques peuvent être utilisés. Un exemple intéressant est l'utilisation de méthanol deutéré comme solvant semi-pola…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée en partie par des subventions en aide à la recherche scientifique pour contester la recherche exploratoire (JK), et la recherche scientifique (A) (JK et SM) du ministère de l'Education, la Culture, des Sports, des Sciences et Technologie, Japon . Un RIKEN FPR bourse (RCE) a fourni un appui supplémentaire. Les auteurs expriment leur gratitude à MM. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama et Mami Okamoto pour l'assistance technique avec la RMN et les analyses statistiques.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | Millipore | XX1002500 | |
| 3-place manifold, 47 mm, stainless steel | Millipore | XX2504735 | |
| KH2PO4 | Wako | 169-04245 | |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
| Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
References
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives. Metabolomics. 5, 3-21 (2008).
- Chikayama, E., et al. Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a single NMR spectrum. Anal. Chem. 82, 1653-1658 (2010).
- Lewis, I. A., Schommer, S. C., Markley, J. L. rNMR: open source software for identifying and quantifying metabolites in NMR spectra. Magn. Reson. Chem. 47, S123-S126 (2009).
- Li, M., et al. Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2117-2122 (2008).
- Mochida, K., Furuta, T., Ebana, K., Shinozaki, K., Kikuchi, J. Correlation exploration of metabolic and genomic diversity in rice. BMC Genomics. 10, 568 (2009).
- Fukuda, S., et al. Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate. Nature. 469, 543-547 (2011).
- Kikuchi, J., Hirayama, T. Practical aspects of stable isotope labeling of higher plants for a hetero-nuclear multi-dimensional NMR-based metabolomics. Methods Mol. Biol. 358, 273-286 (2007).
- Martin, F. P., et al. A top-down systems biology view of microbiome-mammalian metabolic interactions in a mouse model. Mol. Syst. Biol. 3, 112 (2007).
- Mahrous, E. A., Lee, R. B., Lee, R. E. A rapid approach to lipid profiling of mycobacteria using 2D HSQC NMR maps. J. Lipid Res. 49, 455-463 (2008).
- Fukuda, S., et al. Evaluation and characterization of bacterial metabolic dynamics with a novel profiling technique, real-time metabolotyping. PloS ONE. 4, e4893 (2009).
- Date, Y., et al. New monitoring approach for metabolic dynamics in microbial ecosystems using stable-isotope-labeling technologies. J. Biosci. Bioeng. 110, 87-93 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Dynamic omics approach identifies nutrition-mediated microbial interactions. J. Proteome Res. 10, 824-836 (2011).
- Falkowski, P., Barber, R., Smetacek, V. Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production. Science. 281, 200-207 (1998).
- Viant, M. R. Metabolomics of aquatic organisms: the new ‘omics’ on the block. Mar. Ecol. Prog. Ser. 332, 301-306 (2007).
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Evaluation of a semipolar solvent system as a step toward heteronuclear multidimensional NMR-based metabolomics for 13C-labeled bacteria, plants, and animals. Anal. Chem. 83, 719-726 (2011).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6, 277-293 (1995).
- Wang, T., et al. Automics: an integrated platform for NMR-based metabonomics spectral processing and data analysis. BMC Bioinformatics. 10, 83 (2009).
- Eldon, L., et al. BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36, D402-D408 (2007).
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Profiling polar and semipolar plant metabolites throughout extraction processes using a combined solution-state and high-resolution magic angle spinning NMR approach. Anal. Chem. 82, 1643-1652 (2011).
