Konsentrasjon av metabolitter fra lav tetthet Planktoniske Felles innsats for miljøet metabolomics med Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
Summary
En metode for metabolitten utvinning fra mikrobielle planktoniske samfunn blir presentert. Hele samfunnet prøvetaking oppnås ved filtrering på spesielt forberedt filtre. Etter lyophilization, blir vandig vannløselige metabolitter ut. Denne tilnærmingen gjør det mulig for anvendelse av miljø metabolomics til trans-omics undersøkelser av natur-eller eksperimentelt mikrobielle samfunn.
Abstract
Environmental metabolomics er et voksende felt som er fremme ny forståelse i hvordan organismer reagerer på og samhandle med omgivelsene og hverandre på den biokjemiske nivå 1. Nukleær magnetisk resonans (NMR) spektroskopi er en av flere teknologier, blant annet gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS), med betydelige løftet for slike studier. Fordeler med NMR er at det er egnet for vilkårlige analyser, gir strukturell informasjon og spektra kan spørres i kvantitative og statistiske oppførsel mot nylig tilgjengelige databaser av individuell metabolitten spektra 2,3. I tillegg kan NMR spektrale data kombineres med data fra andre omics nivåer (f.eks transcriptomics, genomikk) for å gi en mer helhetlig forståelse av de fysiologiske responser taxa på hverandre og miljøet 4,5,6. Imidlertid er NMR mindre følsom enn andre metabolomic teknikker, noe som gjør det vanskelig å apply til naturlige mikrobielle systemer der utvalg bestander kan være lav tetthet og metabolitt konsentrasjoner lavt i forhold til metabolitter fra veldefinerte og lett utvinnbare kilder som hele vev, biofluids eller celle-kulturer. Følgelig har de få direkte miljømessige metabolomic studier av mikrober utført hittil vært begrenset til kultur-baserte eller lett definert med høy tetthet økosystemer som host-symbiont systemer, konstruerte co-kulturer eller manipulasjoner av tarmen miljø hvor stabile isotop merking kan være i tillegg brukes til å forbedre NMR signaler 7,8,9,10,11,12. Metoder som fremmer konsentrasjonen og innsamling av miljø metabolitter ved konsentrasjoner egnet for NMR mangler. Siden siste oppmerksomhet har blitt gitt til de miljømessige metabolomics av organismer i vannmiljøet, hvor mye av energien og materialflyt er mediert av det planktoniske samfunnet 13,14, har vi utviklet en metode for konsentrasjonsjon og uttak av hel-samfunnet metabolitter fra planktoniske mikrobielle systemer ved filtrering. Kommersielt tilgjengelige hydrofile poly-1 ,1-difluoroethene (PVDF) filtre er spesielt behandlet for å fjerne ekstraherbare, som ellers kan synes som forurensninger i påfølgende analyser. Disse behandles filtrene blir så brukt til å filtrere miljømessige eller eksperimentelle prøver av interesse. Filtre som inneholder den våte prøvematerialet er lyofilisert og vandig-løselige metabolitter er hentet direkte for konvensjonell NMR-spektroskopi ved hjelp av et standardisert kaliumfosfat utvinning buffer to. Dataene fra disse metodene kan analyseres statistisk for å identifisere meningsfulle mønstre, eller integreres med andre omics nivåer for helhetlig forståelse av samfunnet og økosystem funksjon.
Protocol
Discussion
Filtrering og metabolitten utvinning metoden demonstrert her gjør for mikrobiell planktoniske biomasse skal samles i tilstrekkelig mengde for NMR metabolomics. Mens bare utvinning av vandig-løselige metabolitter ved hjelp av KPI og 1D 1 H NMR blir demonstrert, kan andre utvinning løsemidler og spektroskopiske metoder benyttes. Et nyttig eksempel er bruken av deuterert metanol som en semi-polart løsningsmiddel, som har vist seg å produsere overlegen NMR spektra fra heterogene prøver og er mindre følsom …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttes delvis av Grants-i-Aid for Scientific Research for utfordrende utforskende forskning (JK), og forskning (A) (JK og SM) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi Japan . En Riken FPR fellesskap (RCE) gitt ekstra støtte. Forfatterne uttrykke sin takknemlighet til legene. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama og Mami Okamoto for teknisk assistanse med NMR og statistiske analyser.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | Millipore | XX1002500 | |
| 3-place manifold, 47 mm, stainless steel | Millipore | XX2504735 | |
| KH2PO4 | Wako | 169-04245 | |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
| Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
References
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives. Metabolomics. 5, 3-21 (2008).
- Chikayama, E., et al. Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a single NMR spectrum. Anal. Chem. 82, 1653-1658 (2010).
- Lewis, I. A., Schommer, S. C., Markley, J. L. rNMR: open source software for identifying and quantifying metabolites in NMR spectra. Magn. Reson. Chem. 47, S123-S126 (2009).
- Li, M., et al. Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2117-2122 (2008).
- Mochida, K., Furuta, T., Ebana, K., Shinozaki, K., Kikuchi, J. Correlation exploration of metabolic and genomic diversity in rice. BMC Genomics. 10, 568 (2009).
- Fukuda, S., et al. Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate. Nature. 469, 543-547 (2011).
- Kikuchi, J., Hirayama, T. Practical aspects of stable isotope labeling of higher plants for a hetero-nuclear multi-dimensional NMR-based metabolomics. Methods Mol. Biol. 358, 273-286 (2007).
- Martin, F. P., et al. A top-down systems biology view of microbiome-mammalian metabolic interactions in a mouse model. Mol. Syst. Biol. 3, 112 (2007).
- Mahrous, E. A., Lee, R. B., Lee, R. E. A rapid approach to lipid profiling of mycobacteria using 2D HSQC NMR maps. J. Lipid Res. 49, 455-463 (2008).
- Fukuda, S., et al. Evaluation and characterization of bacterial metabolic dynamics with a novel profiling technique, real-time metabolotyping. PloS ONE. 4, e4893 (2009).
- Date, Y., et al. New monitoring approach for metabolic dynamics in microbial ecosystems using stable-isotope-labeling technologies. J. Biosci. Bioeng. 110, 87-93 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Dynamic omics approach identifies nutrition-mediated microbial interactions. J. Proteome Res. 10, 824-836 (2011).
- Falkowski, P., Barber, R., Smetacek, V. Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production. Science. 281, 200-207 (1998).
- Viant, M. R. Metabolomics of aquatic organisms: the new ‘omics’ on the block. Mar. Ecol. Prog. Ser. 332, 301-306 (2007).
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Evaluation of a semipolar solvent system as a step toward heteronuclear multidimensional NMR-based metabolomics for 13C-labeled bacteria, plants, and animals. Anal. Chem. 83, 719-726 (2011).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6, 277-293 (1995).
- Wang, T., et al. Automics: an integrated platform for NMR-based metabonomics spectral processing and data analysis. BMC Bioinformatics. 10, 83 (2009).
- Eldon, L., et al. BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36, D402-D408 (2007).
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Profiling polar and semipolar plant metabolites throughout extraction processes using a combined solution-state and high-resolution magic angle spinning NMR approach. Anal. Chem. 82, 1643-1652 (2011).
