La concentración de los metabolitos de las comunidades planctónicas de baja densidad para la metabolómica ambiental utilizando espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear
Summary
Un método para la extracción de metabolitos microbianos de las comunidades planctónicas se presenta. Muestreo de toda la comunidad se logra por filtración en filtros especialmente preparados. Después de la liofilización, acuoso-solubles metabolitos se extraen. Este enfoque permite la aplicación de la metabolómica ambientales trans-ómicas las investigaciones de las comunidades microbianas naturales o experimentales.
Abstract
Ambiental metabolómica es un campo emergente que está promoviendo una nueva comprensión de cómo responden los organismos e interactuar con el medio ambiente y con los demás a nivel bioquímico 1. Resonancia magnética nuclear (RMN) es una de varias tecnologías, incluyendo la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), con una promesa considerable para este tipo de estudios. Ventajas de la RMN son que es adecuado para los análisis focalizados, proporciona información estructural y los espectros se pueden consultar en las costumbres cuantitativos y estadísticos en bases de datos recientemente disponibles de espectros individuales metabolito 2,3. Además, los datos espectrales de RMN se pueden combinar con los datos de los niveles de otras ómicas (genómica transcriptómica por ejemplo,) para proporcionar una comprensión más completa de las respuestas fisiológicas de los taxones entre sí y el medio ambiente 4,5,6. Sin embargo, RMN es menos sensible que otras técnicas de metabolómicos, lo que hace difícil APcapas de los sistemas microbianos naturales donde la población de la muestra pueden ser las concentraciones de baja densidad y el metabolito de bajo en comparación con los metabolitos de las bien definidas y fácilmente extraíbles, tales como fuentes de tejidos enteros, biofluidos o cultivos celulares. En consecuencia, los pocos estudios ambientales directos metabolómicos de los microbios realizados hasta la fecha se han limitado a base de la cultura-o puede ser definido fácilmente de alta densidad de los ecosistemas tales como los sistemas de acogida-simbionte, construidos co-culturas o manipulaciones del entorno intestinal en el etiquetado de isótopos estables puede ser utiliza también para mejorar las señales de RMN 7,8,9,10,11,12. Los métodos que facilitan la concentración y la recogida de los metabolitos del medio ambiente en concentraciones adecuadas para RMN se carece. Dado que la atención reciente se ha dado a la metabolómica medio ambiente de organismos en el medio acuático, donde la mayor parte del flujo de la energía y el material está mediada por la comunidad planctónica 13,14, hemos desarrollado un método para la concentraciónción y la extracción de toda la comunidad-metabolitos de microbios planctónicos sistemas de filtración. Comercialmente disponibles hidrófilos de poli-1 ,1-difluoroeteno (PVDF) filtros son especialmente tratados para eliminar completamente extraíbles, que de lo contrario pueden aparecer como contaminantes en los análisis posteriores. Estos filtros tratados se utilizan para filtrar las muestras ambientales o experimentales de interés. Filtros que contienen el material de la muestra húmeda se liofilizan y acuosa solubles metabolitos se extrae directamente por espectroscopía de RMN convencional utilizando un fosfato de potasio estandarizado tampón de extracción 2. Los datos derivados de estos métodos pueden ser analizados estadísticamente para identificar patrones significativos, o integrado con otros niveles de ómicas para la comprensión integral de la comunidad y la función del ecosistema.
Protocol
Discussion
El método de extracción de filtración y el metabolito ha demostrado aquí permite la biomasa planctónica microbiana que debe recogerse en cantidad suficiente para la metabolómica RMN. Mientras que la extracción acuosa de sólo solubles en metabolitos utilizando KPI y 1D 1 H RMN se demuestra, otros disolventes de extracción y enfoques espectroscópicos se puede utilizar. Un ejemplo útil es el uso de metanol deuterado como disolvente semipolar, que se ha demostrado para producir espectros de RMN superio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada en parte por subvenciones-en-Ayudas a la Investigación Científica para impugnar la investigación exploratoria (JK), e Investigación Científica (A) (JK y SM) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología, Japón . Un RIKEN FPR comunión (ICE) prestó apoyo adicional. Los autores expresan su agradecimiento a los Dres. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama y Okamoto Mami de asistencia técnica con RMN y análisis estadísticos.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | Millipore | XX1002500 | |
| 3-place manifold, 47 mm, stainless steel | Millipore | XX2504735 | |
| KH2PO4 | Wako | 169-04245 | |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
| Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
References
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