Zebrafish में सिंगल सेल भाग्य मानचित्रण

Summary

नीलम femtosecond लेजर थरथरानवाला: एक विधि के लिए भी एक बंदी फ्लोरोसेंट प्रोटीन युक्त एक तिवारी से दो photon अवशोषण का उपयोग कोशिकाओं photoactivate वर्णित है. भाग्य नक्शा photoactivated सेल, immunohistochemistry प्रयोग किया जाता है. यह तकनीक किसी भी कोशिका प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है.

Abstract

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos^{1, 2}, PAmCherry³, Kaede^4-7, pKindling⁸, and KikGR^{9, 10} have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking¹¹. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems^{7, 12-14}. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation¹⁵, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol¹⁶ to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system.

Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

Protocol

1. बंदी fluorescein-dextran के संश्लेषण (रेफरी से अनुकूलित 14.) 0.1 सोडियम की एम समाधान तैयार DDH 2 ओ में पतला borate 10 केडीए aminodextran 4 मिलीग्राम उपाय है और यह CMNB बंदी fluorescein ट्यूब जोड़ने. तैयार सोडियम borate fluorescein ट्यूब CMNB बंदी समाधान (1.1 कदम) के 500 μL जोड़ें. कैप ट्यूब और 30 सेकंड के लिए भंवर मिश्रण भंग. मिश्रण रात कमरे के तापमान पर एक nutator पर प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति दें. ट्यूब धातु पन्नी के साथ कवर के मिश्रण के परिवेश प्रकाश के लिए जोखिम को रोकने के. एक Zeba फीका बनाना स्पिन और नीचे टोपी दूर स्तंभ मोड़ प्राप्त. मार्क स्तंभ है, जो उन्मुख करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा स्तंभ जब centrifuging पर एक डॉट. एक 15 एमएल शंक्वाकार बाज़ ट्यूब में स्तंभ रखें. नोट: स्पिन स्तंभ में समाधान स्तंभ बफर है. फीका बनाना स्पिन स्तंभ पर शीर्ष टोपी ढीला. 15 एमएल शंक्वाकार बाज़ ट्यूब है कि एक centr में फीका बनाना स्पिन स्तंभ घरों रखेंifuge. ओरिएंट के रूप में चिह्नित डॉट के साथ स्पिन स्तंभ (1.4 कदम) अपकेंद्रित्र रोटर के केंद्र का सामना करना पड़ रहा है. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 1000 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र. Centrifugation के बाद, फाल्कन ट्यूब से फीका बनाना स्पिन स्तंभ को हटाने. दोनों एकत्र प्रवाह के माध्यम से और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब त्यागें. एक नया 15 एमएल शंक्वाकार बाज़ ट्यूब प्राप्त करने के लिए, और नए बाज़ ट्यूब में फीका बनाना स्पिन स्तंभ जगह. नोट: centrifuging बाद, स्तंभ राल बिस्तर दिखाई जमा करना चाहिए. तुरंत स्तंभ का उपयोग करें. 1.3 चरण में प्रतिक्रिया व्यक्त मिश्रण (बंदी fluorescein dextran) प्राप्त करते हैं. स्पिन स्तंभ से टोपी निकालें और प्रतिक्रिया व्यक्त मिश्रण aspirate और यह लागू करने के लिए धीरे धीरे फीका बनाना स्पिन स्तंभ के केंद्र. प्रतिक्रिया व्यक्त मिश्रण को लागू करने के बाद, स्पिन स्तंभ पर टोपी की जगह. बाज़ ट्यूब कि एक अपकेंद्रित्र में फीका बनाना स्पिन स्तंभ घरों रखें. के रूप में 1.5 कदम, पूरबी चिह्नित अपकेंद्रित्र रोटर के केंद्र का सामना करना पड़ डॉट के साथ स्पिन स्तंभ में किया. Centrifugई कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 1000 XG पर ट्यूब. Centrifugation के बाद, एक पीला मिश्रण (बंदी fluorescein dextran) 15 एमएल बाज़ ट्यूब में (लगभग 400 μL) को एकत्र किया जायेगा. एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब बंदी मिश्रण fluorescein dextran स्थानांतरण. तुरंत धातु पन्नी के साथ ट्यूब को कवर करने के लिए परिवेश प्रकाश मिश्रण के प्रदर्शन को रोकने के. बंदी मिश्रण को एक speedvac में fluorescein-dextran Lyophilize. 350 μL के lyophilization लगभग 4 घंटे लेना चाहिए. पूरा lyophilization के बाद, लगभग 1% की एक अंतिम एकाग्रता DDH 2 हे में पाउडर (बारे में 3 मिलीग्राम) resuspend w / v. संक्षेप में करने के लिए पाउडर स्थगित vortexing द्वारा मिक्स. अशेष भाजक अलग धातु पन्नी कवर ट्यूब में fluorescein dextran बंदी है, और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर 2. भ्रूण के संचय और बंदी fluorescein-dextran microinjection * यह प्रक्रिया zebrafish का उपयोग करता हैपशु मॉडल प्रणाली के रूप में. इंजेक्शन से पहले दिन में, की स्थापना की zebrafish पार या तो 1:01 पुरुष के लिए महिला या 2:1 डिवाइडर के साथ टैंक के प्रजनन में पुरुष करने वाली महिला. अगली सुबह प्रजनन टैंक के पानी को बदलने के लिए और डिवाइडर को हटाने. तुरंत या तो 1 एक्स Danieau मीडिया में एक 5 μL 1/10 पतला बंदी fluorescein-dextran काम समाधान (समाधान की तैयारी देखें) या DDH 2 ओ तैयार धातु पन्नी के साथ प्रकाश के लिए जोखिम को रोकने के काम समाधान ट्यूब कवर. विंदुक तैयार बंदी सुई में समाधान fluorescein dextran (2.2 कदम). सुई टिप विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे एक उपयुक्त आकार काटने से पहले, सफेद प्रकाश स्रोत के सामने पारदर्शी पीला फिल्टर का एक टुकड़ा जगह. fluorescein-dextran के पीले फिल्टर इंजेक्शन के दौरान सहज uncaging रोकने जाएगा. जब नेत्र नेत्र टुकड़ा के माध्यम से देख रहे हैं, प्रकाश स्रोत पीला दिखाई देनी चाहिए. भ्रूण को ले लीजिए और उन्हें एक microi में विंदुकnjection मोल्ड ट्रे. Microinjection 4 fluorescein dextran बंदी nl 3 समय देने के लिए सेट करें. विच्छेदन खुर्दबीन के तहत, पूरबी संदंश के साथ भ्रूण और सुई (3 से 4 NL) प्राथमिक कोशिका कोशिकाओं (इंटरफ़ेस – जर्दी ब्लास्टोमीयर) के आधार में fluorescein dextran बंदी. 2 कोशिका चरण – इंजेक्शन के लिए भ्रूण चरण 1 होना चाहिए. इंजेक्शन के बाद, microinjection मोल्ड ट्रे से भ्रूण को हटाने और उन्हें एक साफ ताजा मछली पानी युक्त पेट्री डिश में जगह. Methylene नीले मछली पानी में जोड़ा जा सकता है की एक अंतिम एकाग्रता में 0.02% पर कवक विकास को रोकने के w / v. धातु की पन्नी के साथ पेट्री डिश fluorescein dextran बंदी इंजेक्शन की uncaging को रोकने के कवर. एक मंच पर इंजेक्शन भ्रूण उठाएँ जब ब्याज की कोशिकाओं photoactivated करने की आवश्यकता है. Photoactivation के लिए, DDH 2 ओ में एक 0.6% कम पिघलने agarose समाधान तैयार भ्रूण के मंच पर निर्भर करता है, Tricaine (MS222) कम पिघलने agarose में जोड़ा जा सकता है. ऐसा करने के लिए, 0.0 जलमिश्रित2% कम पिघलने agarose में Tricaine 0.०,०१४% की एक अंतिम एकाग्रता. जैसे ही भ्रूण उपयुक्त विकास मंच तक पहुँचने, संदंश के साथ dechorionate 1 एक्स Danieau मीडिया में भ्रूण. जब dechorionating, यकीन है कि एक पारदर्शी पीला फिल्टर सफेद प्रकाश स्रोत के पथ में रखा गया है (2.3 कदम देखें). 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 0.6% कम पिघलने agarose समाधान गर्मी पिपेट एक LabTek संभाग coverglass स्लाइड के कुएं में 1 कम पिघलने agarose एमएल. ध्यान से नीचे coverslip के खिलाफ नीचे का सामना करना पड़ photoactivated कोशिकाओं के साथ संदंश के साथ करने के लिए 3 से 4 भ्रूण कम पिघलने agarose और उन्हें पूरबी में माउंट. Agarose कठियाना करने की अनुमति दें. Solidification के बाद, पिपेट 1 से अधिक एक्स Danieau मीडिया agarose के 1 एमएल. 2.8 2.9 अधिक भ्रूण के लिए चरणों को दोहराएँ. 3. बंदी fluorescein-dextran के दो photon सक्रियण * यह प्रक्रिया मानता है है कि भ्रूण reporte व्यक्त करता हैr GFP. भ्रूण argon (488 एनएम) लेजर स्रोत आयन LSM 510 मेटा NLO खुर्दबीन जुड़ी का उपयोग करते हुए देखा जाता है. एक एकल GFP सकारात्मक सेल चुना जाता है और माई ताई (femtosecond लेजर) लेजर का उपयोग कर 510 LSM मिलकर photoactivated. प्रक्रिया गैर फ्लोरोसेंट भ्रूण के लिए एक ही है. वैकल्पिक रूप से, सफेद रोशनी सक्रिय किया जा सेल, माई ताई लेजर स्रोत का उपयोग सक्रियण द्वारा पीछा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. LSM 510 सॉफ्टवेयर लोड. सफेद प्रकाश किरण पथ में एक पारदर्शी पीला फिल्टर रखें. स्कैन नई छवि का चयन करें और विशेषज्ञ मोड प्रारंभ क्लिक करें. लेजर टैब का चयन करें. Argon आयन (488 एनएम) और ताई माई (femtosecond) लेजर स्रोतों पर मुड़ें. 740 एनएम माई ताई तरंगदैर्ध्य सेट. कॉन्फिग टैब का चयन करें. आयन argon और माई ताई लेजर के लिए ऑप्टिकल पथ विन्यास सेट. स्कैन टैब का चयन करें. 20X/0.8 उद्देश्य बदलें. अधिकतम क्लिक करके अधिकतम स्कैन गति सेट. सेट मोड, विधि, और लाइन संख्यामतलब है, और 1. चैनल टैब अचयनित माई ताई के अलावा सभी लेजर स्रोतों के तहत. ऑप्टिकल किरण पथ में बिजली मीटर रखें. Cont निरंतर स्कैनिंग को सक्रिय करने के लिए बटन का चयन करें. संचरण% समायोजित बिजली मीटर तक 47 मेगावाट की एक औसत लेसर शक्ति पढ़ता है. बंद बटन का चयन करके स्कैन बंद करो. चैनल टैब अचयनित माई ताई लेजर स्रोत और आयन argon (488 एनएम) का चयन करें के तहत. फास्ट xy बटन का चयन करें. चैनल टैब के तहत pinhole, डिटेक्टर लाभ, ऑफसेट एम्पलीफायर, एम्पलीफायर और आयन argon लेजर के लिए हासिल करने के लिए सबसे अच्छी छवि गुणवत्ता हासिल समायोजित. चरण नियंत्रक का उपयोग कर पाते हैं, और सक्रिय करने के लिए सेल पर ध्यान केंद्रित किया है. बंद करें बटन पर क्लिक करें. में सक्रिय सेल पर ज़ूम उपकरण ज़ूम, जब तक मोड टैब के अंतर्गत ज़ूम कारक 50 से 70 प्रदर्शित करता है का उपयोग करना. बंद बटन का चयन करके स्कैन बंद करो. चैनल टैब अचयनित आयन argon लास के तहत(488 एनएम) एर और माई ताई लेजर का चयन करें. मोड टैब के अंतर्गत 31.46 सेकंड के लिए स्कैन गति निर्धारित किया है. एकल दो photon चयनित सेल के fluorescein dextran बंदी के सक्रियण के लिए स्कैन शुरू बटन का चयन करें. बाद सक्रियण, अचयनित चैनल टैब के तहत माई ताई लेजर, और पुनः आयन argon लेजर (488 एनएम). 1 मोड के तहत ज़ूम कारक सेट, और गति के लिए सबसे तेजी से स्कैन गति सेट शीर्षक के तहत अधिकतम बटन पर क्लिक करें. Photoactivated क्षेत्र की समीक्षा करने के लिए फास्ट xy चुनें. जाँच करें कि photoactivated क्षेत्र है लेजर ablated नहीं है. लेजर पृथक के बारे में अधिक जानकारी के लिए, कृपया चर्चा अनुभाग देखें. अन्य भ्रूण के लिए उपरोक्त चरणों को दोहराएँ. 4. Uncaged fluorescein-dextran Immunodetection (रेफरी से रूपांतरित 16) Photoativation के बाद, सफेद प्रकाश स्रोत के सामने में एक पारदर्शी पीला फिल्टर जगह और मैन्युअल एल से प्रत्येक भ्रूण को हटानेओउ पिघलने agarose तेज संदंश का उपयोग. ताजा 1 एक्स Danieau मीडिया युक्त एक नई पेट्री डिश में सभी को हटा भ्रूण रखें. धातु की पन्नी के साथ पेट्री डिश भ्रूण के प्रकाश के लिए जोखिम को रोकने के कवर. यदि आवश्यक हो, वांछित विकास मंच के पीछे भ्रूण. इस बीच, एक 4% paraformaldehyde समाधान तैयार (समाधान की तैयारी देखें). एक microcentrifuge ट्यूब में 1.5 अशेष भाजक तैयार paraformaldehyde के एमएल. बाद भ्रूण ब्याज की विकास मंच तक पहुँच चुके हैं, microcentrifuge ट्यूब (4.2 कदम से) में भ्रूण विंदुक. कवर धातु पन्नी के साथ प्रकाश के लिए जोखिम को रोकने के ट्यूब. ट्यूब रातोंरात डोलना में 4 डिग्री सेल्सियस अगले दिन के लिए फॉस्फेट बफर (पीबीएस) खारा और DDH 2 हे में वर्गीकृत इथेनॉल (EtOH) समाधान तैयार, 30% EtOH Pbs, 50% EtOH: Pbs, 70% EtOH DDH 2 हे, और 100% EtOH. अगले दिन, 4 डिग्री सेल्सियस से भ्रूण को हटाने धातु ट्यूब को कवर पन्नी निकालें और जल्दी से पैरा aspirateformaldehye (एक छोटी मात्रा कि भ्रूण को कवर करने के लिए पर्याप्त है पीछे छोड़). पिपेट 30% EtOH की 1.5 एमएल: ट्यूब में पीबीएस. धातु पन्नी के साथ ट्यूब कवर. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ट्यूब डोलना. 4.5 50 का उपयोग करते हुए, 70, और 100% EtOH समाधान वर्गीकृत कदम दोहराएँ. 100% EtOH धोने के बाद भ्रूण को फिर से 10 मिनट के लिए 100% EtOH में कुल्ला. Washes के बाद, भ्रूण रातोंरात दुकान -20 डिग्री सेल्सियस अगले दिन के लिए फॉस्फेट तैयार बीच buffered (पीबीटी, समाधान की तैयारी देखें), 5 एक्स अवरुद्ध (तैयार करने के लिए निर्माता प्रोटोकॉल देखें) बफर, maleic एसिड (तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल अवरुद्ध बफर प्रोटोकॉल में पाया जा सकता है), 10 मिग्रा / मिली proteinase कश्मीर, और एक 10 एक्स एंटीबॉडी समाधान (एंटी fluorescein एपी, समाधान की तैयारी देखें). पीबीटी में पतला, इसके अलावा 2% भेड़ का बच्चा सीरम (समाधान की तैयारी देख लोकसभा) तैयार करते हैं. 4 में एंटीबॉडी स्टोर ° C रातोंरात एक nutator पर मिलाते हुए. 2% रास 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है अगले दिन भ्रूण को हटाने-20 डिग्री सेल्सियस से धातु ट्यूब को कवर पन्नी निकालें और जल्दी से 100% EtOH aspirate. ट्यूब DDH 2 हे: 70% EtOH की 1.5 एमएल जोड़ें. धातु पन्नी के साथ ट्यूब कवर. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ट्यूब डोलना. 4.8 50 का उपयोग करते हुए और 30% EtOH समाधान वर्गीकृत, और पीबीटी 100% कदम दोहराएँ. पीबीटी 100% धोने के बाद भ्रूण को 10 मिनट के लिए 3 बार कुल्ला में 100% पीबीटी. यदि भ्रूण 24 घंटे से अधिक पुराने हैं, proteinase कश्मीर उन्हें इलाज. यदि नहीं, 4.13 कदम आगे बढ़ना. ऐसा करने के लिए तैयार proteinase (4.7 कदम) पीबीटी में 1:1000 कश्मीर पतला. Proteinase कश्मीर में 10 मिनट या उससे अधिक समय के लिए भ्रूण सेते अगर भ्रूण पुराने हैं. धातु पन्नी के साथ कवर करने के लिए प्रकाश के लिए जोखिम को रोकने के भ्रूण रखें. Proteinase कश्मीर उपचार के बाद भ्रूण को 10 मिनट के लिए 5 बार धोने पीबीटी में. धोने के बाद, 4% paraformaldehyde में एक nutator पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए भ्रूण को ठीक. उसके बाद, तुरंत भ्रूण 10 मिनट के लिए 5 बार धोने पीबीटी में. भ्रूण रखेंधातु पन्नी के साथ कवर करने के लिए प्रकाश के लिए जोखिम को रोकने के. 5 maleic एसिड बफर में बफर अवरुद्ध एक्स गिराए एक्स 1 पीबीटी से भ्रूण निकालें और उन्हें 1 एक्स बफर रोकने में जगह अवरुद्ध बफर बनाओ. धातु की पन्नी के साथ भ्रूण कवर और उन्हें कमरे के तापमान में 5 से 6 घंटे के लिए डोलना. 5 से 6 घंटे के बाद अवरुद्ध, गर्मी झटका 65 भ्रूण ° सी 15 से 20 मिनट के लिए. एंटीबॉडी समाधान और 2% पिछले दिन तैयार की रास प्राप्त. अधिकतम rpm पर अपकेंद्रित्र एंटीबॉडी समाधान. 2% रास ट्यूब जलीय चरण स्थानांतरण. मिश्रण ट्यूब उलटें. रास एंटीबॉडी मिश्रण बफर अवरुद्ध से भ्रूण स्थानांतरण. धातु पन्नी के साथ कवर करने के लिए प्रकाश के लिए जोखिम को रोकने के भ्रूण रखें. 4 डिग्री सेल्सियस विकेट पर भ्रूण डोलना. अगले दिन कमरे के तापमान पर पीबीटी में 15 मिनट के लिए 6 बार भ्रूण धो लो. एपी बफर (समाधान की तैयारी देखें) तैयार करो. कमरे के तापमान 2 बार में एपी बू में 10 मिनट के लिए भ्रूण धोनेffer. / एनबीटी BCIP विकासशील समाधान (समाधान की तैयारी देखें) तैयार है. / एनबीटी BCIP भ्रूण स्थानांतरण. दाग अंधेरे में विकसित करने के लिए अनुमति दें. भ्रूण पीबीटी में प्रत्येक 5 मिनट के लिए 3 बार धोने से विकास को रोकने. छवि अधिग्रहण के लिए 0.6% कम पिघलने agarose या 3% methylcellulose में भ्रूण माउंट और एक औंधा या ईमानदार यौगिक सूक्ष्मदर्शी का उपयोग कर छवियों को प्राप्त. Photoactivated नमूने उन्हें एक वर्गीकृत EtOH धोने में dehydrating द्वारा भविष्य के विश्लेषण (धुंधला हो स्थिर बनी हुई है) के लिए भंडारित किया जा सकता है. 4.7 के माध्यम से 4.4 नमूने dehydrating के लिए चरणों का पालन करें. 5. प्रतिनिधि परिणाम: चित्रा 1 fluorescein dextran बंदी photoactivation. Brightfield (ए, बी) और photoactivation पहले 13/14-somite स्तर पर एक पार्श्व दृश्य zebrafish भ्रूण की प्रतिदीप्ति छवि. (सी, डी) भ्रूण एक photoactivated किया गया थाएक 740 एनएम के तरंग दैर्ध्य के साथ somites (तीर) में the13/14-somite चरण, 31 सेकेंड का समय है, और 47 मेगावाट की एक औसत लेसर शक्ति स्कैन. डाक सक्रियण, (घ) fluorescein dextran Uncaged से प्रतिदीप्ति मनाया जाता है. अभिविन्यास: (दाएं) पृष्ठीय, वेंट्रल (बाएं). स्केल बार 100 सुक्ष्ममापी. चित्रा 2 fluorescein dextran बंदी Immunodetection. चित्रा 2 एक 18/19 HPF zebrafish भ्रूण में Uncaged fluorescein-dextran immunostaining दर्शाया गया है. मंच 10-कायखंड में भ्रूण के एक छोटे से क्षेत्र में पार्श्व प्लेट ही लेजर चित्रा 1 में कहा गया है मापदंडों का उपयोग कर mesoderm में सक्रिय था. Immunodetection प्रक्रिया का उपयोग करना, तीर न्यूनतम पृष्ठभूमि धुंधला के साथ सक्रिय क्षेत्र को पहचानती है. अभिविन्यास: पृष्ठीय (ऊपर), वेंट्रल (नीचे). स्केल बार 100 सुक्ष्ममापी.

Discussion

इस कागज fluorescein dextran बंदी photoactivation पर आधारित एकल सेल भाग्य मानचित्रण के लिए एक बहुमुखी विधि का वर्णन करता है. Fluorescein-dextran एकल कक्षों में बंदी Uncaging माई ताई femtosecond Zeiss LSM 510 मेटा confocal खुर्दबीन मिलकर लेजर से दो photon अवशोषण का उपयोग कर हासिल की है. Uncaged photoactivated कोशिकाओं में fluorescein dextran तेजी visualized है एक सरल immunohistochemistry प्रक्रिया का उपयोग कर.

इस प्रोटोकॉल में बंदी fluorescein-dextran photoactivation के लिए दो photon अवशोषण तरंग दैर्ध्य 740 एनएम है. यह तरंग दैर्ध्य प्रयोगात्मक बंदी fluorescein dextran इंजेक्शन wildtype भ्रूण photoactivating द्वारा निर्धारित किया गया था. लेजर उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 600 से 800 एनएम से अलग किया गया था, और fluorescein प्रतिदीप्ति पोस्ट सक्रियण की उपस्थिति या अनुपस्थिति गुणात्मक निर्धारित किया गया था. हमने पाया है कि 740 एनएम मजबूत fluorescein संकेत निम्नलिखित सक्रियण का उत्पादन किया. आदर्श रूप में, 740 एनएम सभी के लिए काम करना चाहिएमॉडल प्रणाली है, लेकिन, हम तरंगदैर्य की एक सीमा इष्टतम दो photon अपने नमूने के लिए उत्तेजना तरंग दैर्ध्य निर्धारित परीक्षण की सलाह.

बंदी में fluorescein dextran wildtype भ्रूण इंजेक्शन, के लिए प्रत्येक दो photon तरंगदैर्ध्य उत्तेजना परीक्षण से हम भी औसत लेजर शक्ति विविध. 740 एनएम के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए, 47 के एक औसत लेसर शक्ति मेगावाट सक्रिय क्षेत्र में औसत लेजर शक्तियों को कम करने के लिए तुलना में एक मजबूत fluorescein संकेत का उत्पादन किया. उच्च औसत लेजर शक्तियों को मजबूत fluorescein संकेतों का उत्पादन नहीं किया था, लेकिन ऊतक प्रेरित पृथक. Femtosecond लेजर दालों ablating जैविक ऊतक ¹⁵ में कुशल हैं, तो हम photoactivation कि ऊतक पृथक से बचा जाता है के लिए दहलीज औसत लेसर शक्ति निर्धारित करने की सलाह देते हैं.

दो photon अवशोषण एक छोटे से बातचीत मात्रा के भीतर होता है. बंदी fluorescein-dextran उचित सक्रियण सुनिश्चित करने के लिए, सेल उचित ध्यान में लाया जाना चाहिए. ध मेंप्रोटोकॉल ऊपर ई, GFP पॉजिटिव कोशिकाओं सफेद रोशनी के नीचे एक साथ imaged थे सेल ध्यान केंद्रित की पुष्टि. इसलिए, सफेद प्रकाश अधिग्रहण अन्य चैनलों के अलावा में सलाह दी जाती है. सेल ध्यान केंद्रित की पुष्टि करने के बाद, हमारे प्रोटोकॉल सक्रिय सेल शीशा पता चलता है. 50 से 70 का एक कारक ज़ूम का सुझाव दिया है, हालांकि, इस मूल्य चुना कोशिका के आकार पर निर्भर करता है. ज़ूम बढ़ाने सन्निकट कक्षों से सक्रिय सेल आइसोलेट्स, और दो photon सक्रियण के लिए स्कैन क्षेत्र की सीमा है. आदर्श रूप में, स्कैन क्षेत्र सेल के एक बड़े क्षेत्र को कवर किया जाना चाहिए.

एकल सक्रिय कोशिकाओं का पता लगाने की आवश्यकता है कि पृष्ठभूमि धुंधला हो कम से कम हो सकता है. ऊपर immunodetection प्रोटोकॉल में यह महत्वपूर्ण है कि नमूना 5 से 6 घंटे (4.13 कदम) के लिए बफर रोकने में अवरुद्ध है. जब / एनबीटी BCIP के साथ विकासशील, fluorescein – dextran Uncaged 10 से 20 मिनट में दिखाई बन जाना चाहिए. यदि पृष्ठभूमि धुंधला हो जाना मजबूत है, हम एक लंबे समय तक अवरुद्ध समय और अतिरिक्त washes सुझाव के लिए विरोधी हटानेशरीर (4.17 कदम).

आंकड़े 1 और 2 photoactivation और immunodetection के प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करते हैं. चित्रा 1, 1 जल्दी – 2 कोशिका चरण wildtype भ्रूण fluorescein dextran बंदी के साथ अंतःक्षिप्त थे. भ्रूण मध्य somitogenesis करने के लिए उठाया गया और पार्श्व अभिविन्यास में कम पिघलने agarose में मुहिम शुरू की है. चित्रा 1 (क, ख) photoactivation पहले brightfield और भ्रूण के फ्लोरोसेंट छवियों को दर्शाती है. सबूत है कि भ्रूण Uncaged बने रहे चित्रा 1 (ख) में fluorescein प्रतिदीप्ति के अभाव के द्वारा प्रदर्शन किया है. विखंड भीतर 47 के एक औसत लेजर शक्ति मेगावाट, चित्रा 1 (; तीर ग) का उपयोग कर 31 सेकेंड के लिए 740 एनएम के तरंग दैर्ध्य के साथ एक छोटे से क्षेत्र में सक्रिय था. बाद सक्रियण, fluorescein – dextran के uncaging दो photon हुई के रूप में सक्रिय क्षेत्र, चित्रा 1 (घ, तीर) से प्रतिदीप्ति द्वारा दिखाया. सक्रियकरण लेजर पृथक के साथ नहीं था, रूप में विखंडकीय ऊतक बरकरार, चित्रा 1 (ग) बना रहा है. चित्रा 2 Uncaged स्त्राव के immunodetection को दर्शाता है escein-dextran. एक मंच 10 विखंड भ्रूण के पार्श्व प्लेट mesoderm में एक छोटे से क्षेत्र में ही लेजर मापदंडों का उपयोग कर के रूप में चित्र 1 में वर्णित photoactivated किया गया था. भ्रूण उठाया गया था और 4.20 के माध्यम से 4.1 चरणों का उपयोग संसाधित. चित्रा 2 रेखांकित में तीर सक्रिय क्षेत्र, के रूप में नीले तलछट के संचय से संकेत दिया. स्पष्ट रूप से पृष्ठभूमि धुंधला हो दखल के बिना ही सक्रिय स्थान का पता चला है.

समाधान की तैयारी:

1 एक्स पीबीटी (1 एल)
100 एमएल 10 एक्स पीबीएस
2 ग्राम BSA
बीच 10 एमएल 20%

X 10 पीबीएस (1 एल)
80 ग्राम NaCl
2 ग्राम KCl
6.1 छ ना _{2 4} HPO
1.9 छ ₂ KH पीओ ₄
DDH ₂ 1 एल ओ
7.3 पीएच

4% Paraformaldehyde (160 मिलीलीटर)
32% Paraformaldehyde (दो 10 मिलीलीटर की शीशियों)
8 एमएल 20 एक्स पीबीएस
132 एमएल DDH ₂ हे

jove_content "> एपी बफर (50 एमएल)
1 एमएल 5 एम NaCl
2.5 एमएल 1 एम ₂ MgCl
5 एमएल 1 एम Tris पीएच 9.5
250 μL 20% के बीच
41.25 एमएल DDH ₂ हे

एंटीबॉडी समाधान (नमूना 1 के लिए)
5.5 μL एसीटोन पाउडर
40 μL पीबीटी
0.8 μL LS
0.1 μL एंटीबॉडी विरोधी fluorescein – एपी

2% लोकसभा (1 नमूने के लिए 360 μL)
7.2 μL 100% रास
352.8 μL पीबीटी

1 एक्स Danieau (1 एल) मीडिया ^‡
11.6 एमएल 5 एम NaCl
700 μL 1 एम KCl
400 μL 1 एम MgSO ₄
600 μL एम 1 ₍₃ सं) Ca ₂
5 एमएल 1 एम HEPES
DDH ₂ 1 एल ओ
पीएच 7.6 के लिए समायोजित

^‡ Danieau dechorionated zebrafish भ्रूण के पालन के लिए एक आदर्श नमक समाधान है. अन्य मीडिया का इस्तेमाल किया जा सकता है, वे समर्थक साथ isotonic समाधान प्रदान की जाती हैंPerly osmolarity (~ zebrafish के लिए 300 mOsm)

एनबीटी स्टॉक (1 एमएल)
50 मिलीग्राम नाइट्रो ब्लू Tetrazolium
0.7 एमएल डाइमिथाइल Formamide एनहाइड्राइड
0.3 एमएल DDH ₂ हे

BCIP स्टॉक (1 एमएल)
50 मिलीग्राम 5-ब्रोमो 4 – क्लोरो 3 – indolyl फॉस्फेट
1 एमएल डाइमिथाइल Formamide एनहाइड्राइड

एनबीटी / BCIP विकासशील समाधान
1 एमएल एपी बफर
4.5 μL एनबीटी स्टॉक
3.5 μL BCIP स्टॉक

एसीटोन पाउडर

1. 20 वयस्क मछली का चयन करें और उन्हें तरल नाइट्रोजन में फ्रीज.
2. एक मोर्टार के साथ जमे हुए मछली पीस और एक पाउडर के लिए मूसल.
3. एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में मछली पाउडर स्थानांतरण.
4. 100% एसीटोन के साथ शंक्वाकार ट्यूब भरें. ट्यूब भंवर.
5. अधिकतम rpm पर 10 मिनट के लिए ट्यूब स्पिन. तैरनेवाला त्यागें.
6. गोली 100% एसीटोन में एक और 3 बार धो लें और 10 मिनट के लिए अधिकतम rpm पर ट्यूब स्पिन. बीपिछले धोने तैरनेवाला y स्पष्ट दिखाई देनी चाहिए.
7. गोली के लिए 100% एसीटोन फिर जोड़ें और दो ट्यूब कमरे के तापमान पर खड़े हो जाओ. अधिक घने कणों बसा है, जबकि महीन कणों निलंबन में रहेगा.
8. एक नया ट्यूब में ठीक कणों पसाना. अशेष भाजक अलग ट्यूबों में पाउडर समाधान और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
CMNB-caged fluorescein SE	Invitrogen	C20050
10 kDa Aminodextran	Invitrogen	D1860
Zeba Desalt Spin Column	Pierce	89889
Low melting agarose	Amresco	0815-100G
Sodium Borate	Amresco	1131117-100G
Tricaine Methylsulfonate/ MS222	Research Organics	1347A
Anti-fluorescein-AP	Roche	11376622
Blocking buffer	Roche Applied Sciences	11 096 176 001
Maleic Acid	Sigma	MO375-500G
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714
NBT	Sigma	I8377-250mg
BCIP	Fischer Scientific	PI-34040
Microinjector	Harvard Apparatus	PLI-2000
LabTek chambered coverglass slides	Nalge Nunc International	155380
Proteinase K	Invitrogen	AM2544
Lamb serum	Invitrogen	16070096
LSM 510 META NLO	Zeiss
20X 0.8 NA Air apochromatic objective	Zeiss
Transparent yellow filter	Theatre House Inc.	Roscolux filter sheet Color: 312