L'isolamento e la coltura di cellule staminali neurali Crest di follicoli dei capelli umani

Summary

Questo articolo presenta un protocollo robusto per l'isolamento e la coltura di cellule staminali neurali cresta di follicoli dei capelli umani.

Abstract

Follicoli dei capelli sottoposti a crescita continua e ciclo del capello è un ben controllato processo che coinvolge la proliferazione delle cellule staminali e della quiete. Rigonfiamento dei capelli è una nicchia ben caratterizzato per le cellule staminali adulte ^1. Questo segmento della guaina esterna della radice contiene un certo numero di diversi tipi di cellule staminali, comprese le cellule staminali epiteliali ^2, cellule staminali melanociti ³ e cresta neurale come cellule staminali ^4-7. Follicoli dei capelli rappresentano una fonte accessibile e ricco per i diversi tipi di cellule staminali umane. Noi e gli altri hanno isolato le cellule staminali neurali cresta (NCSCs) di follicoli piliferi umani fetali e adulti ^4,5. Queste cellule staminali umane sono etichette-cellule di sostegno e sono in grado di auto-rinnovamento attraverso la divisione cellulare asimmetrica in vitro. Esprimono immaturi marcatori di cellule neurali della cresta, ma non marcatori di differenziazione. Il nostro studio dei profili di espressione hanno dimostrato di condividere un simile pattern di espressione genica con la pelle di topo immaturo neurale crest cellule. Essi mostrano multipotenza clonale che possono dare origine a linee cellulari miogeniche, melanocitari e neuronale dopo coltura in vitro clonale singola cella. Le cellule differenziate non solo acquisire lineage-specifici marcatori, ma anche dimostrare funzioni appropriate in condizioni ex vivo. Inoltre, questi NCSCs mostrano il potenziale di differenziazione verso linee mesenchimali. Differenziati cellule neuronali possono persistere nel cervello di topo e mantenere marcatori del differenziamento neuronale. E 'stato dimostrato che follicolo pilifero derivato NCSCs può aiutare la ricrescita dei nervi, e migliorare la funzione motoria nei topi trapiantati con queste cellule staminali seguendo sezionare lesione spinale ^8. Inoltre, i nervi periferici sono state riparate con innesti di cellule staminali ^9, e l'impianto di pelle cellule derivate da precursori adiacenti schiacciato nervo sciatico ha portato a rimielinizzazione ^10. Pertanto, i follicolo / pelle NCSCs capelli derivati ​​hanno già mostrato risultati promettenti per rLa terapia egenerative in modelli preclinici.

Riprogrammazione di cellule somatiche di staminali pluripotenti indotte (iPS), le cellule hanno mostrato un enorme potenziale per la medicina rigenerativa. Tuttavia, ci sono ancora molti problemi con le cellule iPS, in particolare l'effetto a lungo termine di oncogene / virus integrazione e tumorigenicità potenziale delle cellule staminali pluripotenti non sono stati adeguatamente affrontati. Ci sono ancora molti ostacoli da superare prima che le cellule iPS possono essere utilizzati per la medicina rigenerativa. Considerando che le cellule staminali sono noti per essere sicuri e sono stati utilizzati clinicamente per molti anni, come trapianto di midollo osseo. Molti pazienti hanno già beneficiato del trattamento. Autologhe cellule staminali adulte sono cellule ancora preferite per il trapianto. Pertanto, le facilmente accessibili ed espandibile cellule staminali adulte in pelle umana / follicoli piliferi sono una fonte preziosa per la medicina rigenerativa.

Protocol

1. Preparazione delle piastre di coltura dei tessuti Coat ogni pozzetto con sufficiente poli-D-lisina (PDL) per coprire il fondo del pozzo. Lasciare le piastre ad asciugare nella cappa. Dopo che i pozzi sono asciutti, risciacquare con acqua sterile, e aspirare. Lasciare le piastre ad asciugare nella cappa. Quando asciutto, cappotto con fibronectina (che è stato disciolto in acqua BioWhittaker notte a 37 ° C ad una concentrazione di 1 mg in 6 ml). Aggiungere mezzo NCSC [95 ml DM…

Discussion

I metodi di isolamento e la coltura di cellule di cui sono riproducibili e robusti. Abbiamo generato NCSCs da decine di persone in una vasta gamma di età. Anche se è meglio per elaborare il tessuto subito dopo la raccolta del tessuto, abbiamo scoperto che i tessuti del cuoio capelluto può essere immagazzinato in modo sicuro nei media sul ghiaccio per il trasporto durante la notte con un impatto minimo sulla vitalità cellulare.

È importante per trattare il tessuto cuoio capelluto con ant…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DMEM	Invitrogen	11965-092
DMEM/F12	Invitrogen	11330-32
Heat-inactivated FBS	Hyclone	SH30071.03
B27 supplement	Invitrogen	17504044
N2 supplement	Invitrogen	17502048
bFGF	Invitrogen	PHG0026
EGF	R&D system	236-EG-01M
IGF-I	R&D system	291-G1-050
0.05% Trypsin/EDTA	Invitrogen	25300-054
Dispase	Invitrogen	17105041
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15070063

Table 1.