Isolasjon og kultur av neural crest stamceller fra Human Hair Follikler

Summary

Denne artikkelen presenterer en robust protokoll for isolering og kultur av neural crest stamceller fra menneskelige hårsekker.

Abstract

Hårsekkene gjennomgå livslang vekst og hår syklusen er en godt styrt prosess som involverer stamceller spredning og ro. Hair bule er et godt karakterisert nisje for voksne stamceller ^en. Dette segmentet av ytre roten kappe inneholder et antall forskjellige typer av stamceller, inkludert epithelial stamceller ^2, melanocyte stamceller ³ og neural crest som stamceller ^4-7. Hårsekkene representerer et tilgjengelig og rik kilde for ulike typer menneskelige stamceller. Vi og andre har isolert neural crest stamceller (NCSCs) fra menneskelige foster og voksen hårsekker ^4,5. Disse menneskelige stamceller plateselskap-støttemurer celler og er i stand til selvfornyelse gjennom asymmetrisk celledeling in vitro. De uttrykker umodne neural crest celle markører, men ikke differensiering markører. Vår uttrykk profilering studie viste at de deler en lignende genuttrykk mønster med murine hud umoden nevrale crest celler. De viser klonal multipotency som kan gi opphav til myogenic, melanocyttisk, og neuronal celle linjer etter in vitro klonal enkelt celle kultur. Differensierte celler ikke bare skaffe avstamning-spesifikke markører, men også demonstrere passende funksjoner i ex vivo forhold. I tillegg er disse NCSCs viser differensiering potensial mot mesenchymale linjene. Differensierte nerveceller kan vedvare i mus hjernen og beholde nevrale differensiering markører. Det har blitt vist at hårsekken utledet NCSCs kan hjelpe nerve gjenvekst, og de ​​forbedrer motorisk funksjon i mus transplantert med disse stamcellene følge transecting ryggmargsskade ^8. Videre har perifere nerver blitt reparert med stamcelleforskningen grafts ⁹ og implantasjon av hud-avledet forløper celler ved siden knust sciatic nervene har resultert i remyelination ^10. Derfor har hårsekken / hud avledet NCSCs allerede vist lovende resultater for regenerative terapi i prekliniske modeller.

Somatisk celle omprogrammering til induserte pluripotente stamceller (iPS) celler har vist et enormt potensial for regenerativ medisin. Men det er fortsatt mange problemer med iPS celler, spesielt på lang sikt effekten av onkogen / virus integrering og potensielle tumorigenitet av pluripotente stamceller har ikke vært godt ivaretatt. Det er fortsatt mange hindringer som skal overvinnes før iPS celler kan brukes til regenerativ medisin. Mens voksne stamceller er kjent for å være sikker og de har blitt brukt klinisk i mange år, slik som benmargstransplantasjon. Mange pasienter har allerede dratt nytte av behandlingen. Autologe voksne stamceller er fortsatt foretrukne celler for transplantasjon. Derfor de lett tilgjengelige og kan utvides voksne stamceller i menneskelig hud / hår follicles er en verdifull kilde for regenerativ medisin.

Protocol

1. Utarbeidelse av vevskulturplater Coat hver brønn med nok Poly-D-lysin (PDL) til å dekke bunnen av brønnen. Tillat platene til tørk i panseret. Etter brønnene er tørre, skyll med sterilt vann, og aspirere. Tillat platene til tørk i panseret. Når tørr, frakk med fibronektin (som ble oppløst i biowhittaker vann over natten ved 37 ° C ved en konsentrasjon av 1 mg i 6 ml). Legg NCSC medium [95 DMEM/F12 ml, 1 ml Penn / Strep (P / S), 1 ml N2, 2 ml B27, 100 pl merkaptoetan…

Discussion

Cellen isolering og kultur som beskrives er reproduserbare og robust. Vi har generert NCSCs fra dusinvis av individer over et bredt spekter av alder. Selv om det er best å behandle vevet rett etter vev innhøsting, fant vi ut at hodebunnen vev kan trygt lagret i media på isen for overnatting transport med minimal innvirkning på celle levedyktighet.

Det er viktig å behandle hodebunnen vev med antibiotika og bruke aseptisk teknikk ved hårsekken isolasjon for å unngå potensiell mikroorga…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DMEM	Invitrogen	11965-092
DMEM/F12	Invitrogen	11330-32
Heat-inactivated FBS	Hyclone	SH30071.03
B27 supplement	Invitrogen	17504044
N2 supplement	Invitrogen	17502048
bFGF	Invitrogen	PHG0026
EGF	R&D system	236-EG-01M
IGF-I	R&D system	291-G1-050
0.05% Trypsin/EDTA	Invitrogen	25300-054
Dispase	Invitrogen	17105041
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15070063

Table 1.