זיהום של ההכנות של הריבוזומים אוקריוטים מטוהרים באמצעות שיטות מסורתיות על ידי שיתוף טיהור nucleases ו פרוטאזות משפיע לרעה על ניתוחים ביוכימיים ומבניים במורד הזרם. שיטה מהירה ופשוטה טיהור chromatographic משמש כדי לפתור את הבעיה הזו באמצעות הריבוזומים שמרים כמערכת מודל.
Abstract
הריבוזומים האיקריוטים הם הרבה יותר יציב לעומת עמיתיהם eubacterial ו archael שלהם, ובכך פוזות אתגר משמעותי לחוקרים. מדאיג במיוחד הוא העובדה תמוגה של תאים משחרר מספר גדול של פרוטאזות ו nucleases אשר יכול לבזות הריבוזומים. לכן, חשוב להפריד בין הריבוזומים של אנזימים אלה מהר ככל האפשר. למרבה הצער, שיטות קונבנציונליות ultracentrifugation ההפרש עלים הריבוזומים חשופים אנזימים אלה לתקופות ארוכות של זמן בלתי מתקבל על הדעת, המשפיעים על השלמות המבנית ואת הפונקציונליות שלהם. כדי לטפל בבעיה זו, אנו מנצלים שיטה chromatographic באמצעות ציסטאין טעונה Sulfolink שרף. יישום פשוטה ומהירה מפחית באופן משמעותי את שיתוף טיהור פעילויות proteolytic ו nucleolytic, ייצור של תשואות גבוהות, ריבוזומים שלמים שמרים מאוד פעיל ביוכימית. אנו מציעים שיטה זו צריך להיות גם ישים הריבוזומים יונקים. הפשטות שלהשיטה, ועל טוהר פעילות משופרת של הריבוזום מטוהרים chromatographically מייצג התקדמות טכניים משמעותיים לחקר הריבוזומים האיקריוטים.
Protocol
1. הכנת ציסטאין טעונה Sulfolink שרף הכן Sulfolink שרף (פירס) בטמפרטורת החדר. המקום כולל של 10 מ"ל של slurry של 50% ג'ל Sulfolink צימוד כפי שסופק בשתי צלוחיות פלסטיק 10 מ"ל על ידי היצרן, עם 5 מ"ל מופץ לתוך בק?…
Discussion
פרוטוקולים טיהור ריבוזום בעצם כרוך תאים lysing, קצירת חלק מן cytosolic ספין במהירות נמוכה ולאחר מכן pelleting הריבוזומים על ידי צנטריפוגה מהירות גבוהה 1. בעוד כמה שיטות הרומן שימשו לטיהור הריבוזומים חיידקי, אותו לא היה נכון לגבי אאוקריוטים 2-4. למרות צעדים נוספים נוספ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו רוצים להודות לכל חברי המעבדה Dinman, כולל אשטון Belew, קארן ג'ק, Sharmishtha Musalga, סרגיי Sulima, Shivani Reddy, מיכאל רודין על עזרתם קלט על הפרויקט הזה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים AM מן איגוד הלב האמריקני (AHA 0630163N) ו JDD מן המכונים הלאומיים לבריאות (5R01 GM058859-12). ג'אל נתמכה על ידי מהשקעה Recovery Act האמריקאי תוספת של 2009 כדי להעניק את ההורה (3R01GM058859-11S1).
Meskauskas, A., Leshin, J. A., Dinman, J. D. Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes. J. Vis. Exp. (56), e3214, doi:10.3791/3214 (2011).