成像白细胞粘附到血管内皮细胞在高腔内压力

Summary

这是一个可视化白细胞粘附到内皮收获压力容器的方法。该技术使研究不同的腔内压力高达200毫米汞柱，从而模拟高血压的病理生理条件下剪切流动的血管粘连。

Abstract

据报道，约四分之一的人口在世界范围内，高血压和死亡率全球领先的生物医药风险因素。在血管性高血压与血管内皮功能障碍和增加炎症导致动脉粥样硬化和各种疾病，如慢性肾脏^病 ，中风³和心力衰竭4国。在血管炎症导致动脉粥样硬化的最初步骤，其中包括通过血管内皮细胞的滚动，圈养，坚持和随后轮回白细胞的粘附级联。招聘和血管内皮细胞白细胞的积累是介导的粘附分子如血管细胞粘附分子-1（VCAM – 1），细胞内的细胞粘附分子1（ICAM – 1）和E -选择以及增加的上调细胞因子和趋化因子的释放和活性^氧上调5。，帮助在体外培养的方法，如静态粘附检测，以确定参与细胞-细胞粘附机制以及细胞粘附分子的分析。在以前聘用的方法在体外研究表明，急性血管内皮细胞上的压力增加可导致单核细胞粘附，粘附分子和炎症标志^物的上调6然而，在许多体外试验类似，这些研究结果并没有被实时执行生理流动条件下，也与全血。因此， 在体内实验中越来越多地利用在动物模型中表现出血管炎症和斑块的发展。活体显微镜是目前广泛使用的评估白细胞粘附，轧件，迁移和轮回^7-9。当上的白细胞内皮细胞粘附在体内研究相结合的压力的影响不太广泛。这样的一个研究探讨动脉生长和重塑，但炎症标志物的流动和剪切的实时效果，只有通过^免疫组织化学10评估。在这里，我们提出了一个完好加压的血液，使用全血灌注血管的实时记录白细胞粘附的模型。方法是体外血管腔灌注模型^9，使实时分析的白细胞与内皮完整的血管粘合剂相互作用的修改。我们的修改，使操纵的腔内压力高达200毫米汞柱，不仅在生理流动条件，但也压力条件下的研究。虽然压力myography系统此前已证明，观察血管壁和管腔直径¹¹以及血管收缩，这是首次展示实时的白细胞-内皮相互作用。在这里，我们展示了收获大鼠颈总动脉插管至一个定制的流室加上荧光显微镜技术，使用。船只室配有一个大的底部，让一个大口径物镜工作距离短，以形象船只玻璃罩。此外，选定的激动剂和/或拮抗剂可以利用控制细胞粘附的机制，以进一步调查。活体显微镜这种方法的优点包括没有介入微创手术，因此可以得到更高的吞吐量。这种方法也可以使用本地化抑制剂治疗所需的船只，而活体不仅能使全身抑制剂治疗。

Protocol

1。隔离颈动脉 Euthanase10周龄SD大鼠，通过CO 2 / O 2的窒息。 海关左，右颈总动脉与主动脉和心脏，确保最小伸展的船只。 在冰冷的克雷布斯缓冲区单独的颈动脉从主动脉和心脏，并进行密切的夹层。 在安装前，置于冰上克雷布斯隔离的船只。 约。时间= 45分钟 2。促发血管腔近端和远端血管腔冲洗克雷布斯注入carbogen天然气（95％O 2 5％的CO 2）保持在生理pH值的缓冲连接器，通过缓冲在37 ° C。 确保油管和套管完全刷新和对齐。 通过P1（近端）和P2（远端）传感器冲洗Kreb缓冲区。关闭水龙头，以确保在传感器无气泡。 传感器连接到相应的连接器，并再次刷新更多克雷布斯缓冲区，确保无气泡。关上水龙头会议厅。 约。时间= 15分钟 3。加压容器室打开压力设备：伺服压力，压力显示器，蠕动泵（图1）。 通过油管在20毫米汞柱（拨打1）确保无气泡，随着压力和压力伺服自动运行克雷布斯缓冲区的蠕动泵。 连接管封闭P2传感器。压力将趋于稳定。 P2的水龙头打开血管腔冲洗掉任何气泡，然后关闭掉。 填写浴用Krebs缓冲液（5 – 7毫升）。 约。时间= 10分钟 4。安装船只在解剖显微镜放到每个套管黑色聚酯关系（图2）。 移动套管和套管持有人除了安装¼船只上的P1导管（主动脉弓完）。确保不撕裂船只。 使用填补了注射器用Krebs缓冲液轻轻冲洗多余的血液船只通过P1的传感器。关上的P1室。 聚酯领带的小套管的安全船只。 移动到P2套管安装套管/套管持有人接近。 山末端的船只（长度¼）到远端插管。安全与聚酯领带。 约。时间= 20分钟 5。加压容器调整套管持有人，以确保没有弯曲或伸展在船只。 P1和P2封闭的腔压力伺服自动切换到手动。压力伺服检查有没有在10秒内的压力不断减少。如果有，发生泄漏的连接和传感器需要的地方担保。 调整压力伺服自动然后打开P2室。在显微镜下观察血管扩张时打开水龙头室。 开关压力伺服手册。再次检查在10秒内的压力不断减少。如果有泄漏，则系统不施加压力，紧张，有可能是在船上的洞。 切换回自动打开P1的会议厅。说明书上设置检查，压力保持稳定。 如果没有泄漏，手动设置增加拨号2（40毫米汞柱）。 调整自动，并在显微镜下观察的船只。如果有必要，调整的导管支架，以确保在vessel.Check没有手动设置泄漏的弯曲。 增加表盘3（60毫米汞柱），4（80毫米汞柱），直到达到所需的压力是等重复步骤5.6 – 5.7。 约。时间= 15 – 30分钟 6。孵化的压力容器连接温度控制器设定到37 ° C。 随着第二个蠕动泵灌注克雷布斯缓冲液（1毫升/分钟）入血管腔洗澡。 宇航员室确保只有顶层洗澡的连接被删除。 在37 ° C孵育1小时设置为自动压力压力容器。 检查压力不泄漏（切换至手动）定期。 通过简单地增加孵化过程中的化合物洗澡，可以观察各种药物干预的影响。 约。时间= 1小时 7。全血灌流压力容器孵化过程中获得至少7.5毫升全血/肝素40 U / mL的血液收集容器。在50毫升猎鹰在37 ° C。 结束前10分钟的T他VybrantDil 10分钟（1:1000）孵育标签血液在37 °在C黑暗。 10分钟后，血液收集在清除任何气泡的注射器和附加到一个注射器泵热夹克在37 ° C。 P1的传感器关闭室/船只和连接注射器和废物管。 清除血液在1000μL/分钟通过废物管，以消除任何气泡。 打开P1的会议厅。压力伺服会自动进行调整，以保持所需的压力。 灌注100μL/ min的血。 使用荧光显微镜，再加上一台数码相机记录两个领域的灌注船只为15秒1，3，5，7.5和10分钟。 邮政灌注内皮细胞的完整性和功能，可以评估通过药理技术，如肌动描记和粘附分子的表达，可以通过免疫组织化学的决心，进一步验证了炎症反应。 约。时间= 15分钟 8。代表性的成果： 一个压力室设置的示意图如图1所示。随着数码相机，加上荧光显微镜结果立即通过现场录像可以可视化。代表视频图像看到图3中的白细胞被认为是附着内皮如果他们仍然固定为10秒。录像上连续循环坚持细胞，可以算作一个平均每场。虽然都低（ 图3A）和高（ 图3B）的压力会造成一定的附着量显着增加白细胞粘附在更高的腔内压力是看到，这也表明定量（ 图 4 ）。 图1。加压体外血管腔示意图 ，一个空心的容器，连接到近端（P1）的传感器和一个远端（P2）的传感器，使血压内的船舶操纵。灌注通过P1传感器和压力是保持通过P2传感器。 图2。黑色聚酯关系与联系Cannuala。连接到每个套管。 图3。代表动态的视频图像。细胞粘附在荧光（红色箭头），在80毫米汞柱（A）和120毫米汞柱（b）在灌注10分钟。 图4。斯普拉格Dawley白细胞粘附颈动脉后1小时在低潜伏期（80毫米汞柱）和高压（120毫米汞柱）。 *** P <0.001，为2路反复的措施，使用Bonferroni后特别测试ANOVA分析。

Discussion

这是修改后的的方法来研究实时加压条件下的完整的隔离血管内皮白细胞粘附。单独的血管腔灌注，使一个大小鼠和大鼠血管的促炎症株的快速验证。启用的压力操纵允许动态的细胞间的相互作用，以观察从低到非常高的腔内压力，从而更好地模拟生理和病理条件。血管直径也可以用足够的细胞成像方案，因此剪切流动和速率可确定，因此操作。

凭借其肌动描记能力，放置在洗澡的药理干预添加另一个层面可能的实验条件下，这种模式使机理和信号通路的研究。虽然内皮保护不能在压力操纵证实，对乙酰胆碱和PE的反应，可进行后^灌注 9 。

应该指出的是，此设置演示腔内压力的影响，在细胞与细胞之间的相互作用不是搏动性血流量，也不收缩压或舒张压的影响。此外，白细胞粘附的急性压力的变化进行观察时，这种设置可以还利用来看待慢性压力的影响（即增加孵育时间和使用一种慢性压力的动物模型）。斯普拉格Dawley颈总动脉中演示了这一套，但其他菌株和物种可能用于套管大小适当调整。事实上，重要的是要注意动物的年龄和体重的影响船只的大小，因此，设立需要因材施教，为每艘船舶。关闭并仔细解剖结缔组织可以可视化极大地提高白细胞。

Materials

Name of the reagent/equipment	Company	Catalogue number	Comments
Microscope	Carl Zeiss, Inc	SteREO Discovery V.20
PHD 2000 Syringe Pump	Harvard Apparatus	70-2016
Digital Camera and Controller	Hamamatsu ORCA-ER	C4742-95
Fluorescence Illumination System	Lumen Dynamics	X-Cite 120
Vessel Chamber	Living Systems Instrumentation	CH/1/SH
Pressure Servo Controller and Peristaltic Pump	Living Systems Instrumentation	PS – 200
Perfusion Pressure Monitor	Living Systems Instrumentation	PM – 4
2 x Pressure Transducer	Living Systems Instrumentation	PT – F
Temperature Controller	Living Systems Instrumentation	TC-01
Peristaltic Pump	Instech Laboratories, Inc	P720
VybrantDil cell-labelling solution	Invitrogen	V-22885	Use 1:1000