Detectie en Genogrouping van Norovirussen van Children's Krukken Door Taqman een stap RT-PCR
Summary
Een stap RT-PCR voor de detectie en genogroup identificatie van Norovirus isolaten van kinderen ontlasting dat primers en TaqMan probes specifiek voor de open reading frame 1 (ORF1)-ORF2 grensgebied, de geconserveerde regio van de Norovirus genoom gebruikt beschreven. Een niet-commerciële, kosteneffectieve RNA-extractie methode wordt beschreven.
Abstract
Norovirussen (NoVs) zijn de belangrijkste oorzaak van het uitbreken van sporadische acute gastro-enteritis over de hele wereld bij mensen van alle leeftijden. Zij zijn belangrijke oorzaak van ziekenhuisopnamen bij kinderen met volksgezondheidseffect vergelijkbaar met die van Rotavirus. NoVs zijn RNA virussen grote verscheidenheid genetische en er een continue weergave van nieuwe stammen. Vijf genogroepen worden erkend; GI en GII met hun vele genotypen en subtypen het meest belangrijk zijn voor menselijke besmetting. Echter, de diagnose van deze twee genotypes blijft problematisch, het uitstellen van diagnose en behandeling. 1, 2, 3
Voor RNA-extractie uit ontlasting specimens de meest gebruikte methode is de QIAmp Viraal RNA commerciële kit Qiagen. Deze methode worden de bindende eigenschappen van een silicagel membraan buffers die controle RNAses, voor een optimale binding van de RNA de kolom met de snelheid van Microspin. Deze methode is eenvoudig, snel en betrouwbaar en is carrIED in een paar stappen die worden beschreven in de beschrijving van de fabrikant.
Norovirus is de tweede alleen voor rotavirus de meest voorkomende oorzaak van diarree. Norovirus diagnose moet beschikbaar zijn in alle onderzoeken naar pathogenese van diarree en bij uitbraken of individuele diarree gevallen. Momenteel echter norovirus diagnose slechts een beperkt aantal centra door het ontbreken van eenvoudige technieken voor de diagnose. Dit vertraagt de diagnose en behandeling 1, 2, 3. Daarnaast is vanwege de kosten en gereguleerde transport van corrosieve buffers binnen en tussen landen het gebruik van deze gefabriceerde kits stelt logistieke problemen. Hierdoor, in dit protocol beschrijven we een alternatieve, economisch eigen methode is gebaseerd op de originele Boom et al.. Methode 4 waarin het nucleïnezuur bindingseigenschappen van silicadeeltjes gebruikt samen met de anti-nuclease eigenschappen guanidiniumthiocyanaat .
<p class="Jove_content"> Voor de detectie en genogrouping (GI en GII) van NoVs isolaten van ontlasting exemplaren, een aantal RT-PCR-protocollen gebruik te maken van verschillende doelwitten zijn ontwikkeld. De consensus is dat een RT-PCR met behulp van TaqMan chemie zou de beste moleculaire techniek voor de diagnose te zijn, want het combineert een hoge gevoeligheid, specificiteit en reproduceerbaarheid met een hoge doorvoersnelheid en gebruiksgemak. Hier beschrijven een assay gericht op de open reading frame 1 (ORF1)-ORF2 grensgebied; de geconserveerde regio van de NoV genoom en dus vooral geschikt voor diagnose. Voor verdere genetische analyse een conventionele RT-PCR is dat het zeer variabele N-terminal-shell richt de belangrijkste capside eiwitten van de (Region C) met primers oorspronkelijk beschreven door Kojima et al.. 5 is beschreven. Sequencing van het PCR-product van de conventionele PCR maakt de differentiatie van genotypes die tot GI en GII genogroepen.Protocol
Discussion
De economische eigen methode voor het isoleren van nucleïnezuur uit ontlasting wij gelijke resultaten verkregen als bij de commerciële QIAmp Viraal RNA kit Qiagen, samen met de TaqMan RT-PCR ontwikkeld in ons laboratorium kunnen detecteren breed NoV genotypen die behoren tot de GI en GII genogroup. Een recente publicatie van de regio C-protocol gemeld genotypering tarieven van 78% 6. Omdat de diversiteit van de hedendaagse NoV stammen is toegenomen in de voorgaande jaren zal het succes afhankelijk is van de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag naar het Nationaal Calicivirus Laboratorium Center for Disease Control and Prevention (CDC) bedanken voor de vriendelijke gift van een standaard en controle positieven voor de NOV, en de laboratoria van de School of Public Health aan de Johns Hopkins voor het leveren van de reagentia.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Guanidine isothiocyanate | Sigma-Adrich | G9277 | |
| Tris HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Silica | Sigma-Aldrich | S5631 | |
| Triton X 100 | BDH Chemicals | 14530 | |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| QIAamp viral RNA Mini Kit (250) | QIAGEN | 52906 | |
| QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) | QIAGEN | 204443 | |
| Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) | QIAGEN | 210212 | |
| Rnase Inhibitor 2000 units | A.Biosystems | N808-0119 | 2000 unids/vial |
| Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes | Ambion | AM12450 | |
| UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550-100 |
References
- Medici, M. Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy. L. Medical Virology. 78, (2006).
- Vidal, R. Novel recombinant Norovirus causing outbreaks of gastroenteritis in Santiago, Chile. J. Clinica Microbiology. 4, (2006).
- Xavier, M. Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil. Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).
- Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
- Kojima, S. Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses. J. Virol. Methods. 100, 107-114 (2002).
- Mattison, K. Multicenter comparison of two norovirus ORF2-based genotyping protocols. J. Clin. Microbiol. 47, 3927-3932 (2009).
- Trujillo, A. A. Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus. J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).
- Kageyama, T. A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR. J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).
