Upptäckt och Genogrouping av norovirus från Barnens Pallar Genom Taqman Ett steg RT-PCR

Summary

En enstegs RT-PCR-analys för detektion och gengrupp identifiering av Norovirus isolat från barn avföring, som utnyttjar primers och TaqMan-prober är specifika för den öppna läsramen 1 (ORF1)-ORF2 förbindelseregion, den mest konserverade regionen av Norovirus genomet är beskrivits. En icke-kommersiell, kostnadseffektiv RNA-extraktion metod detaljerade.

Abstract

Norovirus (NoVs) är den vanligaste orsaken till utbrott av sporadisk akut gastroenterit i hela världen hos människor i alla åldrar. De är viktiga orsak till sjukhusinläggningar hos barn med en inverkan på folkhälsan som liknar rotavirus. NoVs är RNA-virus med stor genetisk mångfald och det finns en kontinuerlig uppkomsten av nya stammar. Fem genogrupper redovisas, GI och GII med sina många genotyper och subtyper är det viktigaste för människor infektion. Emellertid förblir diagnos av dessa två genotyper problematisk, fördröja diagnos och behandling. ^{1, 2, 3}

För RNA-extraktion från avföringsprover den vanligast använda metoden är den QIAmp virala RNA kommersiellt kit från Qiagen. Denna metod kombinerar de bindande egenskaperna hos en silikagel-membran, buffertar som kontrollerar RNaser och tillhandahåller optimal bindning av RNA till kolonnen tillsammans med den hastighet MicroSpin. Denna metod är enkel, snabb och pålitlig och CarrIED i några steg som anges i den beskrivning som tillhandahålls av tillverkaren.

Norovirus är näst rotavirus som den vanligaste orsaken till diarré. Norovirus diagnosen bör finnas i alla studier av patogenes av diarré samt utbrott eller enskilda fall diarré. För närvarande dock norovirus diagnosen är begränsad till endast ett fåtal centra på grund av bristen på enkla metoder för diagnos. Detta fördröjningar diagnos och behandling ^{1, 2, 3.} På grund av kostnader och reglerad transport av korrosiva buffertar inom och mellan länder användning av dessa tillverkade satser utgör logistiska problem. Som ett resultat, i detta protokoll beskriver vi ett alternativt, ekonomisk, intern metod som är baserad på den ursprungliga Boom et al. Metod ^4, som använder den nukleinsyrabindande egenskaper kiseldioxidpartiklar tillsammans med de anti-nukleas egenskaper guanidiniumtiocyanat .

<p class="Jove_content"> För att upptäcka och genogrouping (GI och GII) av NoVs isolat från avföringsprov, flera RT-PCR protokoll använder olika mål har utvecklats. Enighet råder om att en RT-PCR med TaqMan kemi skulle vara det bästa molekylära tekniken för diagnos, eftersom den kombinerar hög känslighet, specificitet och reproducerbarhet med hög genomströmning och användarvänlighet. Här beskriver vi en analys målsökande den öppna läsramen 1 (ORF1)-ORF2 förbindelseregion, och den mest konserverade regionen av NOV-genomet och därmed mest lämplig för diagnos. För ytterligare genetisk analys av en konventionell RT-PCR-riktad mot den mycket varierande N-terminal-skal från det huvudsakliga proteinet i kapsiden (region C) med användning av primrar som ursprungligen beskrivits av Kojima et al. ⁵ visas i detalj. Sekvensering av PCR-produkten från den konventionella PCR möjliggör differentiering av genotyper som hör till GI och Gli genogrupper.

Protocol

1. Avföringsprover Avföringsprover bör lagras fruset för att bevara RNA. För att göra en 10% fekal suspension, tar cirka 0,1 g tinade avföringsprov och komplettera till 1 ml med PBS. Alikvot av 200 pl att undvika upprepad frysning och tining. Lagra alikvoter vid -70 ° C. Tina och centrifugera portioner vid 4.000 g under 10 minuter före användning för extraktion. 2. Framställning av silikapartiklar för extraktion med guanidin och kiseldioxid </p…

Discussion

Med användning av ekonomiska intern metod för isolering av nukleinsyra från avföringsprover, vi erhålla samma resultat som med kommersiella QIAmp virala RNA-kit från Qiagen, och tillsammans med TaqMan RT-PCR utvecklades i vårt laboratorium har vi kan detektera ett brett spektrum av NOV genotyper som hör till GI och GII gengrupp. En nyligen utkommen publikation av regionen C-protokollet rapporterade genotypning andelen 78% ^6. Eftersom mångfald samtida nov stammarna har ökat under tidigare år kommer …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Guanidine isothiocyanate	Sigma-Adrich	G9277
Tris HCL	Sigma-Aldrich	T5941
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Silica	Sigma-Aldrich	S5631
Triton X 100	BDH Chemicals	14530
Diethylpyrocarbonate	Sigma-Aldrich	D-5758
QIAamp viral RNA Mini Kit (250)	QIAGEN	52906
QuantiTec Probe RT-PCR kit (200)	QIAGEN	204443
Qiagen One Step RT-PCR Kit (200)	QIAGEN	210212
Rnase Inhibitor 2000 units	A.Biosystems	N808-0119	2000 unids/vial
Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes	Ambion	AM12450
UltraPure Agarose 1000	Invitrogen	16550-100