En enkel och snabb metod för att bestämma försockringen potential stort antal prover växtbiomassa beskrivs. Den automatiserade plattform för denna analys består i att anläggningen biomassa för analys i 96 brunnar och den efterföljande prestanda förbehandling, hydrolys och kvantifiering av den frigjorda socker.
Polysackarider som utgör anläggningen lignocellulosa kan brytas ned för att producera en rad olika sockerarter som sedan kan användas i upprättandet av ett bioraffinaderi. Dessa råvaror skulle innebära en ny industriell plattform, som är både hållbar och koldioxidneutral, att ersätta det nuvarande beroendet av fossila bränslen. Den motspänstighet att dekonstruktion observerats i lignocellulosa är producerad av flera inneboende egenskaper växternas cellväggar. Kristallin cellulosa är inbäddad i matrisen polysackarider som xylans och arabinoxylaner, och hela strukturen är inkapslad av fenol polymer lignin, som är också svårt att smälta 1. I syfte att förbättra smältbarheten av vegetabiliskt material vi behöver för att upptäcka de viktigaste flaskhalsarna för försockring av cellväggarna och även skärmen mutant och populationer avel för att bedöma variationen i försockring 2. Dessa uppgifter kräver en hög genomströmning metod och här presenterar vi en analytisk plattform som kan utföra försockringen analys i ett 96-brunnar format. Denna plattform har utvecklats för att screening av lignocellulosa smältbarhet av stora populationer från olika växtarter. Vi har skalat ner reaktionen volymer för skonsam förbehandling, partiella enzymatisk hydrolys och socker beslutsamhet, så att ett stort antal som ska bedömas snabbt i ett automatiserat system.
Denna automatiserade plattform fungerar med milligram mängder biomassa, utföra bollen fräs under kontrollerade förhållanden för att minska växtmaterial till en standardiserad partikelstorlek på ett reproducerbart sätt. När proverna marken, delar ut den automatiska formateringen roboten specificerade och inspelade mängder av material till motsvarande brunnar på 96 djupa brunnar (Figur 1). Normalt dosera vi samma material i 4 brunnar har 4 replikat för analys. När plattorna är fyllda med växtmaterial i önskad layout, de är manuellt flyttas till en vätskehantering station (Figur 2). I denna station proverna utsätts för en mild förbehandling med antingen utspädd syra eller basiska och inkuberas vid temperaturer upp till 90 ° C. Förbehandling lösningen därefter bort och proverna sköljas med buffert för att returnera dem till ett lämpligt pH-värde för hydrolys. Proven inkuberas sedan med ett enzym blandning för en variabel tid vid 50 ° C. En alikvot tas från hydrolysatet och reducerande socker automatiskt bestäms av MBTH kolorimetriska metoden.
Variations of the standard saccharification protocol can be used in the same platform for determining the activity of cellulolytic enzymes (i.e. by variation of the enzyme concentrations used in a plate as well as using paper as substrate); comparison of the efficiency of several enzyme mixtures on a specific material; time course for saccharification; etc.
A standard saccharification protocol to compare the saccharification potential in different plant materials involves an eight hour hydrolysis (Figures 3 and 4). Most of the plant materials analysed requires four replicates. Under these conditions, the platform can process 80 samples/day. This analysis is being used to screen large populations of barley, maize, and brachypodium in order to establish variability in saccharification potential and the genes involved in its determination4.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka A Viksø-Nielsen (Novozymes) för gåvan av cellulolytic enzymer. Detta arbete har finansierats av FP7 FÖRNYADE och BBSRC projekt BB/G016178 och BB/G016194.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Grinding & weighing robot | Labman Automation | |
2 ml micro tube with caps | Sarstedt Ltd | 72.694 |
5 mm stainless steel beads | Qiagen Ltd | 69989 |
1.2ml Abgene square well storage plates | Fisher Scientific Ltd | TUL-050-050C |
Whatman cap mat for 96 square well plates | Fisher Scientific Ltd | 7704-0104 |
Liquid hanling robot | Tecan Group Ltd. | Freedom Evo 200 |
Sulphuric acid | Fisher Scientific Ltd | S/9231/PB17 |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific Ltd | BPE359-500 |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750-500G |
Acetic acid | Fisher Scientific Ltd | A/0420/PB17 |
Novozyme 188 | Novozyme | DCN00214 |
Celluclast 1.5L | Novozyme | CCN03122 |
96 well PCR full skirt plates | Sarstedt Ltd | 72.1980.202 |
D-Glucose | Fisher Scientific Ltd | G/0450/53 |
3-Methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | 129739-25G |
DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9163-1G |
Corning microplate 96 well flat bottom | Fisher Scientific Ltd | TKT-521-050H |
Ammonium iron (III) sulfate dodecahydrate | Sigma-Aldrich | F1668-250G |
Sulfamic acid | Sigma-Aldrich | 242772-500G |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific Ltd | 12462-0026 |