Les changements d'équilibre dans la structure de l'ARN de surveillance par «peroxydation» et «oxydatif» Hydroxyl Footprinting Radical
Summary
Ce protocole décrit comment quantifier les Mg (II)-dépendante de la formation de l'ARN structure tertiaire par deux méthodes d'empreinte radical hydroxyle.
Abstract
Molécules d'ARN jouent un rôle essentiel dans la biologie. En plus de transmettre l'information génétique, l'ARN peut incorporer uniques structures tertiaires remplir un rôle de régulateur biologiques spécifiques, liant ou de catalyseur. Information sur la formation de contacts tertiaire est essentielle pour comprendre la fonction des molécules d'ARN. Les radicaux hydroxyles (OH •) sont des sondes unique de la structure des acides nucléiques en raison de leur grande réactivité et une petite taille. 1 Lorsqu'il est utilisé comme une sonde d'empreinte, les radicaux hydroxyles cartographier la surface accessible au solvant de l'squelette phosphodiester de l'ADN et l'ARN 1 2 avec aussi fine que la résolution seul nucléotide. Hydroxyle empreinte radical peut être utilisé pour identifier les nucléotides au sein d'une surface de contact intermoléculaires, par exemple en ADN-protéines et d'ARN une teneur en protéines complexes. Equilibre et cinétique 3 4 transitions peut être déterminé en effectuant des empreintes hydroxyles radicaux en fonction d'une solutisur la variable ou l'heure, respectivement. Une caractéristique clé de l'empreinte est que l'exposition limitée à la sonde (par exemple, "la cible unique cinétiques») des résultats de l'échantillonnage uniforme de chaque nucléotide du polymère. 5
Dans cet article, vidéo, nous utilisons le domaine P4-P6 du ribozyme de Tetrahymena pour illustrer la préparation des échantillons d'ARN et la détermination d'un Mg (II)-médiée isothermes pliantes. Nous décrivons l'utilisation du protocole bien connu l'empreinte de radicaux hydroxyles qui nécessite H 2 O 2 (nous appelons cela la "peroxydante« protocole) et une valeur, mais pas très connu, alternative qui utilise naturellement dissous O 2 (nous appelons cela «l' oxydatif "protocole). Un aperçu de la réduction des données, la transformation et les procédures de l'analyse est présentée.
Protocol
Discussion
Hydroxyle empreinte radicale est un outil précieux pour évaluer la surface accessible au solvant des acides nucléiques. La formation quantitative et qualitative de la structure tertiaire 14 peut être suivie en fonction de paramètres tels que le type et la concentration d'ions, pH, température, protéines de liaison ou de pliage des co-facteurs. La combinaison convaincante d'un protocole simple et peu coûteux et l'accessibilité résultant de solvant et de l'information pliage sur un seu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions du National Institute of Health RO1-GM085130 et la National Science Foundation MCB0929394. Nous remercions le Dr Marion Schmidt pour son hospitalité et pour nous permettre de filmer dans son laboratoire.
Materials
| Name | Company | Cat# |
|---|---|---|
| Sodium Cacodylate (Caution! Toxic) | Sigma | C4945-25g |
| EDTA (0.5 M) | Ambion | AM9260G |
| DEPC treated water | Ambion | AM9915G |
| Sodium Acetate (3 M) | Ambion | AM9740 |
| MgCl2 (1 M) | Ambion | AM9530G |
| Urea | Ambion | AM9902 |
| Sodium Citrate | Sigma | W302600 |
| tRNA | Sigma | R-7876 |
| Sodium-L-ascorbate | Sigma | A7631-25g |
| Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O | Sigma | F1543-500g |
| RNase T1 | Fermentas | EN0541 |
| Hydrogen Peroxide (30%) | Sigma | 349887 |
References
- Tullius, T. D., Dombroski, B. A. Hydroxyl radical “footprinting”: high-resolution information about DNA-protein contacts and application to lambda repressor and Cro protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5469-5473 (1986).
- Celander, D. W., Cech, T. R. Iron(II)-ethylenediaminetetraacetic acid catalyzed cleavage of RNA and DNA oligonucleotides: similar reactivity toward single- and double-stranded forms. 생화학. 29, 1355-1361 (1990).
- Celander, D. W., Cech, T. R. Visualizing the higher order folding of a catalytic RNA molecule. Science. 251, 401-407 (1991).
- Sclavi, B., Sullivan, M., Chance, M. R., Brenowitz, M., Woodson, S. A. RNA folding at millisecond intervals by synchrotron hydroxyl radical footprinting. Science. 279, 1940-1943 (1998).
- Tullius, T. D., Dombroski, B. A., Churchill, M., Kam, L. Hydroxyl radical footprinting: a high-resolution method for mapping protein-DNA contacts. Methods. Enzym. 155, 537-558 (1987).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic. Acids. Res. 15, 8783-8798 (1987).
- Schlatterer, J. C., Brenowitz, M. Complementing global measures of RNA folding with local reports of backbone solvent accessibility by time resolved hydroxyl radical footprinting. Methods. 49, 142-147 (2009).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
- Zaug, A. J., Grosshans, C. A., Cech, T. R. Sequence-specific endoribonuclease activity of the Tetrahymena ribozyme: enhanced cleavage of certain oligonucleotide substrates that form mismatched ribozyme-substrate complexes. 생화학. 27, 8924-8931 (1988).
- Knapp, G. Enzymatic approaches to probing of RNA secondary and tertiary structure. Methods. Enzym. 180, 192-212 (1989).
- Slatko, B. E., Albright, L. M. Denaturing gel electrophoresis for sequencing. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 7, Unit 7.6-Unit 7.6 (2001).
- Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. SAFA: semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments. RNA. 11, 344-354 (2005).
- Simmons, K., Martin, J. S., Shcherbakova, I., Laederach, A. Rapid quantification and analysis of kinetic *OH radical footprinting data using SAFA. Methods. Enzym. 468, 47-66 (2009).
- Uchida, T., He, Q., Ralston, C. Y., Brenowitz, M., Chance, M. R. Linkage of monovalent and divalent ion binding in the folding of the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme. 생화학. 41, 5799-5806 (2002).
- Cate, J. H., Gooding, A. R., Podell, E., Zhou, K., Golden, B. L., Kundrot, C. E., Cech, T. R., Doudna, J. A. Crystal structure of a group I ribozyme domain: principles of RNA packing. Science. 273, 1678-1685 (1996).
- Petri, V., Brenowitz, M. Quantitative nucleic acids footprinting: thermodynamic and kinetic approaches. Curr. Opin. Biotechnol. 8, 36-44 (1997).
- Takamoto, K., Das, R., He, Q., Doniach, S., Brenowitz, M., Herschlag, D., Chance, M. R. Principles of RNA compaction: insights from the equilibrium folding pathway of the P4-P6 RNA domain in monovalent cations. J. Mol. Biol. 343, 1195-1206 (2004).
- Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods. Enzym. 130, 132-181 (1986).
- Shcherbakova, I., Mitra, S. Hydroxyl-radical footprinting to probe equilibrium changes in RNA tertiary structure. Methods. Enzym. 468, 31-46 (2009).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly. Curr. Opinion. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).
- McGinnis, J. L., Duncan, C. D., Weeks, K. M. High-throughput SHAPE and hydroxyl radical analysis of RNA structure and ribonucleoprotein assembly. Methods. Enzym. 468, 67-89 (2009).
- Jonikas, M. A., Radmer, R. J., Laederach, A., Das, R., Pearlman, S., Herschlag, D., Altman, R. B. Coarse-grained modeling of large RNA molecules with knowledge-based potentials and structural filters. RNA. 15, 189-199 (2009).
