Övervakning Jämvikt Förändringar i RNA-struktur med "Peroxidative" och "oxidativ" hydroxylradikaler footprints
Summary
Detta protokoll beskriver hur man kvantifiera Mg (II)-beroende bildning av RNA-tertiär struktur genom två metoder för hydroxylradikaler footprints.
Abstract
RNA-molekyler spelar en viktig roll i biologi. Förutom att överföra genetisk information, kan RNA lägga till unika tertiära strukturer som uppfyller en viss biologisk roll som regulator, bindemedel eller katalysator. Information om tertiära kontakt bildning är avgörande för att förstå funktionen av RNA-molekyler. Hydroxylradikaler (• OH) är unika sonder av strukturen hos nukleinsyror grund av sin höga reaktivitet och liten storlek. 1 När den används som en footprints sond, hydroxylradikaler karta lösningsmedlet åtkomlig yta phosphodiester ryggraden i DNA-1 och RNA 2 med lika bra som enda nukleotid upplösning. Hydroxylradikaler footprints kan användas för att identifiera nukleotider i en intermolekylär kontaktyta, t ex i DNA-protein-1 och RNA-protein komplex. Jämvikt 3 och kinetiska 4 övergångar kan bestämmas genom att utföra hydroxylradikaler footprints som en funktion av en solutipå rörliga eller tid, respektive. En viktig funktion i footprints är att begränsad exponering till sonden (t.ex. "single-hit kinetik") resulterar i en enhetlig provtagning av varje nukleotid av polymer. 5
I den här videon artikeln använder vi den P4-P6 domän Tetrahymena ribozyme att illustrera RNA provberedning och bestämning av ett Mg (II)-medierad fällbara isotermer. Vi beskriver användningen av den välkända hydroxylradikaler footprints protokoll som kräver H 2 O 2 (Vi kallar detta "peroxidative" protocol) och en värdefull, men inte allmänt känt, alternativ som använder naturligt löst O 2 (Vi kallar detta " oxidativ "Protocol). En översikt av datareduktion, omvandling och förfaranden analys presenteras.
Protocol
Discussion
Hydroxylradikaler footprints är ett värdefullt verktyg för att bedöma lösningsmedlet åtkomlig yta av nukleinsyror. Kvalitativa och kvantitativa bildandet av tertiärstruktur 14 kan följas som en funktion av parametrar som jon-typ och koncentration, pH, temperatur, bindande proteiner eller vikning co-faktorer. Den övertygande kombination av en rak och billig protokoll och den resulterande lösningsmedel tillgänglighet och vikning information på en enda nukleotid nivå gör denna metod mycket attrakti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institute of Health RO1-GM085130 och National Science Foundation MCB0929394. Vi tackar Dr Marion Schmidt för sin gästfrihet och för att tillåta oss att filma i hennes laboratorium.
Materials
| Name | Company | Cat# |
|---|---|---|
| Sodium Cacodylate (Caution! Toxic) | Sigma | C4945-25g |
| EDTA (0.5 M) | Ambion | AM9260G |
| DEPC treated water | Ambion | AM9915G |
| Sodium Acetate (3 M) | Ambion | AM9740 |
| MgCl2 (1 M) | Ambion | AM9530G |
| Urea | Ambion | AM9902 |
| Sodium Citrate | Sigma | W302600 |
| tRNA | Sigma | R-7876 |
| Sodium-L-ascorbate | Sigma | A7631-25g |
| Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O | Sigma | F1543-500g |
| RNase T1 | Fermentas | EN0541 |
| Hydrogen Peroxide (30%) | Sigma | 349887 |
References
- Tullius, T. D., Dombroski, B. A. Hydroxyl radical “footprinting”: high-resolution information about DNA-protein contacts and application to lambda repressor and Cro protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5469-5473 (1986).
- Celander, D. W., Cech, T. R. Iron(II)-ethylenediaminetetraacetic acid catalyzed cleavage of RNA and DNA oligonucleotides: similar reactivity toward single- and double-stranded forms. 생화학. 29, 1355-1361 (1990).
- Celander, D. W., Cech, T. R. Visualizing the higher order folding of a catalytic RNA molecule. Science. 251, 401-407 (1991).
- Sclavi, B., Sullivan, M., Chance, M. R., Brenowitz, M., Woodson, S. A. RNA folding at millisecond intervals by synchrotron hydroxyl radical footprinting. Science. 279, 1940-1943 (1998).
- Tullius, T. D., Dombroski, B. A., Churchill, M., Kam, L. Hydroxyl radical footprinting: a high-resolution method for mapping protein-DNA contacts. Methods. Enzym. 155, 537-558 (1987).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic. Acids. Res. 15, 8783-8798 (1987).
- Schlatterer, J. C., Brenowitz, M. Complementing global measures of RNA folding with local reports of backbone solvent accessibility by time resolved hydroxyl radical footprinting. Methods. 49, 142-147 (2009).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
- Zaug, A. J., Grosshans, C. A., Cech, T. R. Sequence-specific endoribonuclease activity of the Tetrahymena ribozyme: enhanced cleavage of certain oligonucleotide substrates that form mismatched ribozyme-substrate complexes. 생화학. 27, 8924-8931 (1988).
- Knapp, G. Enzymatic approaches to probing of RNA secondary and tertiary structure. Methods. Enzym. 180, 192-212 (1989).
- Slatko, B. E., Albright, L. M. Denaturing gel electrophoresis for sequencing. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 7, Unit 7.6-Unit 7.6 (2001).
- Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. SAFA: semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments. RNA. 11, 344-354 (2005).
- Simmons, K., Martin, J. S., Shcherbakova, I., Laederach, A. Rapid quantification and analysis of kinetic *OH radical footprinting data using SAFA. Methods. Enzym. 468, 47-66 (2009).
- Uchida, T., He, Q., Ralston, C. Y., Brenowitz, M., Chance, M. R. Linkage of monovalent and divalent ion binding in the folding of the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme. 생화학. 41, 5799-5806 (2002).
- Cate, J. H., Gooding, A. R., Podell, E., Zhou, K., Golden, B. L., Kundrot, C. E., Cech, T. R., Doudna, J. A. Crystal structure of a group I ribozyme domain: principles of RNA packing. Science. 273, 1678-1685 (1996).
- Petri, V., Brenowitz, M. Quantitative nucleic acids footprinting: thermodynamic and kinetic approaches. Curr. Opin. Biotechnol. 8, 36-44 (1997).
- Takamoto, K., Das, R., He, Q., Doniach, S., Brenowitz, M., Herschlag, D., Chance, M. R. Principles of RNA compaction: insights from the equilibrium folding pathway of the P4-P6 RNA domain in monovalent cations. J. Mol. Biol. 343, 1195-1206 (2004).
- Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods. Enzym. 130, 132-181 (1986).
- Shcherbakova, I., Mitra, S. Hydroxyl-radical footprinting to probe equilibrium changes in RNA tertiary structure. Methods. Enzym. 468, 31-46 (2009).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly. Curr. Opinion. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).
- McGinnis, J. L., Duncan, C. D., Weeks, K. M. High-throughput SHAPE and hydroxyl radical analysis of RNA structure and ribonucleoprotein assembly. Methods. Enzym. 468, 67-89 (2009).
- Jonikas, M. A., Radmer, R. J., Laederach, A., Das, R., Pearlman, S., Herschlag, D., Altman, R. B. Coarse-grained modeling of large RNA molecules with knowledge-based potentials and structural filters. RNA. 15, 189-199 (2009).
