Prøvepræparation, Imaging, og Analyse protokoller for knivsæg Scanning Mikroskopi

Summary

Den fulde proces fra hjernen prøvepræparation til seriel inddele billeddannelse ved hjælp af Knife-Edge Scanning Microscope, at data visualisering og analyse er beskrevet. Denne teknik er i øjeblikket anvendes til at erhverve mus hjernen data, men det gælder for andre organer, andre arter.

Abstract

Store fremskridt i high-throughput, høj opløsning, 3D-mikroskopi-teknikker har muliggjort købet af store mængder af neuroanatomiske data på submicrometer opløsning. En af de første sådanne instrumenter producerer hel-hjerne-skala data er den knivsæg Scanning Microscope (KESM) ^{7, 5, 9,} udviklet og hostet i forfatternes lab. KESM er blevet brugt til afsnittet og image hele musen hjerner på submicrometer opløsning, afslører indviklede detaljer i det neurale netværk (Golgi) ^{1, 4, 8,} vaskulære netværk (tusch) ^{1, 4,} og cellen kroppen distribution (Nissl) ³ . Brugen af ​​KESM er ikke begrænset til musen eller hjernen. Vi har med succes afbildet blæksprutten hjernen ^6, mus lunge, og rotte hjerne. Vi arbejder i øjeblikket på hele zebrafisk embryoner. Data, som disse kan i høj grad bidrage til connectomics forskning ^10, at mikrocirkulationen og hæmodynamisk forskning og stereologi forskning ved bestemDing en nøjagtig jord-sandhed.

I denne artikel vil vi beskrive den udvikling, herunder prøvepræparation (fastsættelse, farvning, og indlejring), KESM konfiguration og opsætning, sektionering og billedbehandling med KESM, billedbehandling, data forberedelse, og data visualisering og analyse. Der lægges vægt på prøvepræparation og visualisering / analyse af de indhentede KESM data. Vi forventer, at detaljeret protokol præsenteret i denne artikel for at bidrage til at udvide adgangen til KESM og øge dets udnyttelse.

Protocol

1. Prøvepræparation: Golgi-Cox Denne protokol følger nøje protokollen af Mayerich et al. 7. Den C57BL/6J musen er dybt bedøvet ved hjælp af isofluran inhalant narkose og derefter halshugget. Hjernen er fjernes og placeres i en Golgi-Cox fiksering opløsning (1% kaliumchromat, 1% kaliumdichromat, og 1% kviksoelvklorid i deioniseret vand). Hjernen er tilbage i Golgi-Cox løsning i mørke, ved stuetemperatur i 10 til 16 uger. De hjerner er skylles i deioniseret vand natten i mørke. Den skyllede hjernen er nedsænket i 5% ammoniumhydroxidoploesning i deioniseret vand i 7 til 10 dage i mørke ved stuetemperatur. Denne lange forberedelsestid var at sikre infiltration af hele hjernen, så den sorte bundfald havde en chance for helt at form i vævet. Hjernen er skylles igen i deioniseret vand ved stuetemperatur i 4 timer og thøne dehydreret gennem en gradueret række ethyl alkohol: 50% og 70% i køleskab (4 ° C), og 85%, 95% (3 ændringer), og 100% (4 til 5 ændringer) i stuetemperatur. Hjernen er tilbage i hver enkelt løsning i 24 timer. Den dehydrerede hjerne er så sat i acetone (3 til 4 ændringer, hver for en dag), efterfulgt af en Araldite-acetone blanding med Araldite-til-acetone forholdet 1:2, 1:1, 2:1, og endelig i 100% Araldite (3 ændringer, hver gang natten over), i køleskab (4 ° C). Endelig er de behandlede hjernen indlejret i 100% Araldite og opvarmet til 60 ° C i 3 dage (jf. indlejring protokollen i Abbott og Sotelo 2). Hvis prøver er indlejret i LR White så enhederne er overført fra de sidste 100% ethanolopløsning gennem tre ændringer i LR Hvide løsning, der hver især opbevares i køleskab natten over, hvilket er en standard procedure forud for polymerisering. Tre ændringer er gjort for at sikre fuld infiltration. Prøven er thøne overført til frisk LR White, der er polymeriseret i en lukket beholder ved 60 ° C i 24 timer, som er den nødvendige mængde af tid og temperatur for korrekt polymerisering. Fig. 1 viser en Golgi-Cox farves hjerne indlejret i Araldite. Den hærdede prøve blokken er derefter monteret på metal-prøven ringen ved hjælp af epoxy, og siderne af blokken trimmet som nødvendigt (se fig. 2). 2. Prøvepræparation: Nissl Musen er dybt bedøvet med ketamin og xylazin (1,7 mg ketamin / 0,26 mg xylazin pr 20 g kropsvægt) injiceres intraperitonealt og derefter perfunderet transcardially med 50 mL stuetemperatur fosfat-bufferet saltvand (pH 7,4), efterfulgt af 250 ml af plads temperatur 10% neutral bufferet formalin (pH 7,4). og endelig med 3,0 cc ufortyndet tusch. Hele kroppen perfusion med saltvand og fiksativ er nødvendigt at rydde blod fra det kardiovaskulære system, og at fastsætte TI PØRGSMÅL. Perfusion med tusch er nødvendigt helt at fylde kar af det kardiovaskulære system. Den resulterende hjerne er så dehydreret gennem en serie af gradueret ethyl alkohol (25% -100%) og derefter indlejret i Araldite plast efter protokollen i 1,8-1,9 ovenfor. Hvis LR hvid er integreringstilladelserne medium derefter protokol i 1,10 ovenfor er fulgt. 4. Prøvepræparation: Generisk arter, generiske organer For den generiske tilfælde kan fiksering gøres med enten 10% neutral bufferet formalin eller 4% paraformaldehyd. For små væv mængder, er udbredelsen i stedet for perfusion anbefales til fiksering og farvning. I tilfælde af små organismer eller organer, kan farvning også ske i løbet af dehydrering processen. Den indlejring Protokollen er den samme som ovenfor, selv om tidspunkter for løsningen infiltration kan reduceres til organer eller organismer, der er meget mindre end hele musen hjernen. jove_title "> 5. KESM opsætning og billedbehandling Sluk pumpe, drej på scenen, tænde kameraet, tænd illuminator. Løft kniv og mål. Installer prøven ring. Mål prøven dimension og oprette en konfigurationsfil for KESM Stage Controller2 ansøgning. Start KESM Stage Controller2 og initialisere scenen. Lavere kniv / mål, tænd pumpen. Fokus objektiv og kamera, ved at dreje fokus knappen på det optiske toget og justere kameraets synsfelt i forhold til den knivsæg. Tryk på [GO] for at indlede billeddannelse. Se fig. 3-8. Se 9, 7 for tekniske detaljer. 6. Billedbehandling og data tilberedning Kopier KESM Stack Processor eksekverbare i data mappen under konfigurationsfilen mappe (00000, 00001, etc.). Kør KESM Stack Processor at fjerne belysning artefakt og normalisere baggrunden intensitet i allebilleder. Gentag for alle data undermapper. Forbered multiscale fliser fra datasæt og uploade og oprette filer i KESM Brain Atlas webserver. Se Fig. 9. 7. Visualisering af data og analyse Visualisering ved hjælp af KESM Brain Atlas. Gå til http://kesm.cs.tamu.edu og vælg den relevante atlas. Naviger som i Google Maps. Zoom ind og ud som i Google Maps. Sådan går du til en anden dybde, skal du vælge hvor dybt til at gå på hvert trin fra pull-down menuen, og klik derefter på enten [+] eller [-] for at øge eller mindske z dybde. Juster overlay nummeret ved hjælp af pull-down menuen. Juster overlay intervallet ved hjælp af pull-down menuen. Se Fig. 11. Visualisering ved hjælp MeVisLab. Start MeVisLab. Opret et nyt projekt. I det følgende kan nye moduler kan skabe af Typing i modulet navn i kommando boksen. Opret modul [Compose3Dfrom2DFiles], og gå til den ønskede mappe. Indtast fil snor og klik i [GetFileList]. Sørg for, at de valgte billeder kan være i hukommelsen. Klik på [Create3D] for at skabe volumen. Opret modul [SetWorldMatrix], og sæt "Scale" under "Elementær Transformeringer" x, y, z til den relevante voxel størrelse (0,6, 0,7, 1,0 for en 10X 0.45NA mål). Link [Compose3Dfrom2DFiles] til [SetWorldMatrix]. Set Matrix og transformerer under "Matrix Composition" til "Ignorer", "Ignorer", "Fremad". Opret modul [Arithmetic1] og indstil "Function" til "Invert (Max-Img)". Link [SetWorldMatrix] til [Arithmetic1]. Opret modul [View3D] og forbinde [Arithmetic1]. I View3D, mens højre museknap er trykket bevæger musen rundt for at justere tærsklen. Du kan beskære regioner, ændre retning (flyt musen, mens venstre museknap er trykket ned), ændre belysning (volumen rendering eller MIP), tænd / sluk baggrund osv. Se Fig. 10. 8. Repræsentative resultater: Her præsenterer vi hel-hjerne-data og detaljer. Figner. 12-15 Vis hele-hjerne-tusch, Golgi, og Nissl datasæt 1, 4, 3. Figur 1. Fast, farves, og indlejret mus hjerne Figur 2. Embedded musen hjernen eksemplar monteret på prøven ring. Figur 3. The Knife Edge Scanning Microscope (KESM). Et foto af KESM er vist med dets vigtigste komponenter mærket: (1) high-speed line-scan kamera, (2) mikroskop mål, (3) diamant kniv samling og lys kollimator, (4) SPEcimen tank (for nedsænkning i vand billeddannelse), (5) tre-aksen præcision air-bærende etape, (6) hvidt lys mikroskop illuminator, (7) vandpumpe (på bagsiden) til fjernelse af sektioneret væv (8) PC-server til fase kontrol og billede erhvervelse, (9) granit base, og (10) granit bro. Figur 4. Imaging principper KESM. Den vigtigste af driften af ​​KESM er illustreret. Målet og kniven holdes på plads, mens prøven anbringes på positioneringen scenen bevæger sig (pil med solide linie) ved opløsning af 20 nm og kørehastighed på 1-5, og får skrabet mod diamant kniven (5 mm brede til 10X objektiv), generere en tynd sektion flyder over kniv (pil med fuldt optrukket linie). Line-scan billeddannelse sker tæt på selve spidsen af ​​kniven. Figur 5. KESM kamera og objektiv koncentrere kontrollen. Figur 6. KESM kniv montage og kontrol. Figur 7. Indledende fokus ved observation porten. Figur 8. KESM Stage Controller 2-ansøgning (screenshot). Figur 9. KESM stack processor program (screenshot). Figur 10. MeVisLab ansøgning (screenshot). <br/> Figur 11 KESM Brain Atlas:. Web-interface (screenshot). Figur 12. KESM hel-hjerne-tusch data. Bind visualiseringer af KESM data stakke er vist for de vaskulære datasæt. (A) Close-up af de vaskulære data. Bredde ~ 100 um. (Bd) Tre standard udsigt over hele musen hjernen vaskulaturen (subsampled fra data i høj opløsning). Bredde ~ 10mm. Figur 13. KESM hel-hjerne mus Golgi data. Figur 14. KESM Golgi data detaljer. Figur 15. KESM hel-hjerne Nissl data. (A) Close-up af Nissl data. ~ 300 um 3. (Bd) Tre standard udsigt over hele musen hjernen Nissl data (subsampled fra data i høj opløsning). Tværsnit vist for et klart billede af de interne strukturer.

Discussion

Det KESM giver mulighed for en submicrometer-niveau undersøgelse af store mængder af biologisk prøve (~ 1 cm ^3). Denne form for volumen nok til at holde helt små dyr organer, såsom hjerne, lunger, hjerter, nyrer osv. Scannede billeder fra disse organer kan give hidtil uset kvantitative oplysninger om de strukturelle organisering af disse organer, og gør det muligt datamodellering af forskellige funktionelle aspekter af disse organer, herunder kredsløb og netværk dynamik, elektriske egenskaber, væske og luft flow dynamik, og muskuløs dynamik.

Den prøvepræparation protokol og post-analyse protokol beskrevet i denne artikel, forventes at hjælpe uden forskergrupper til at få lettere adgang til KESM og de resulterende data. Den KESM operation Protokollen vil hjælpe disse eksterne forskere at værdsætte de fordele og begrænsninger af denne enestående imaging modalitet.